Science Advances（IF 12.5）：油酸钠/棕榈酸钠模拟MASLD肝细胞脂毒性微环境并 诱导小鼠肝细胞（AML12、PMH）以建立体外细胞模型

1. 研究背景

这篇发表于《Science Advances》的研究聚焦于代谢相关脂肪性肝病（MASLD）的早期发病机制，技术背景涉及肝脏空间生物学、内皮细胞异质性与代谢调控的交叉领域。肝脏沿门静脉-中央静脉轴线呈现典型的代谢分区（zonation），肝细胞在不同区域执行迥异的代谢功能，而近年单细胞与空间转录组学进展揭示，非实质细胞如肝窦内皮细胞（LSECs）同样具有鲜明的区域化特征。LSECs不仅构成血管屏障，更通过旁分泌信号主动调控肝细胞稳态，其c-Kit表达沿中央静脉至门静脉呈梯度递减，是内皮分区的关键标志。然而，在MASLD早期，脂质沉积为何偏好中央静脉区，以及LSEC分区如何参与这一过程，此前尚不明确。视黄酸（RA）作为维生素A的活性代谢物，是核受体RXR的内源性配体，在糖脂代谢与免疫调控中具有多效性，但其在内皮细胞中的直接靶基因及抗脂肪肝效应通路亦待阐明。该研究综合运用条件性基因敲除小鼠、多组学测序（单细胞转录组、空间转录组、批量RNA-seq）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）及大规模临床营养数据库（NHANES）分析，系统解析了LSEC分区在MASLD起始阶段的功能意义。

2. 技术路线

在技术路线上，研究者首先通过高脂饮食（HFD）诱导的小鼠模型及临床活检样本，明确早期脂肪变性呈中央静脉区优势分布。随后，利用内皮特异性c-Kit敲除与过继回输模型，证实中央静脉（PC）区LSEC来源的c-Kit具有抗脂肪肝保护作用。为鉴定下游效应分子，整合c-Kit阳性LSEC转录组与分泌组数据库，筛选出FGF1作为候选旁分泌因子，并通过体外肝细胞脂毒性模型与体内重组蛋白干预，验证FGF1经FGFR4受体抑制脂质合成的功能。进一步机制探索发现，c-Kit通过维持核受体RXRG的表达，直接转录激活FGF1；而RA作为RXRG激动剂，可有效上调LSEC中FGF1表达并改善MASLD表型。最后，利用NHANES数据建立膳食维生素A摄入与MASLD风险的负向流行病学关联，形成从分子机制到人群证据的完整链条。在细胞实验层面，研究分离原代小鼠肝细胞与LSEC，建立棕榈酸钠和油酸钠诱导的脂毒性细胞模型，以此验证FGF1的降脂效应及其受体特异性，并通过RXR激动剂/拮抗剂处理、过表达与RNA干扰等手段，在LSEC细胞系Bend.3与原代细胞中明确RXRG对FGF1的直接转录调控，从而在体外重建c-Kit-RXRG-FGF1信号轴的核心环节。

3. 高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，使用油酸钠、棕榈酸钠作为高脂细胞添加剂处理小鼠肝细胞系（AML12）及原代小鼠肝细胞（PMH），成功诱导显著的细胞内脂滴堆积，帮助分析代谢功能障碍相关脂肪性肝炎的病理变化。

该高脂细胞添加剂（货号KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的油酸钠、棕榈酸钠相比，具有如下显著优点：

1）该试剂的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒试剂，确保实验结果可靠。

2）该试剂常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

3）该试剂为液体溶液，浓度准确，可以直接溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作，能够呈现清晰的剂量依赖性趋势。

需要说明的是，棕榈酸钠具有更强的促炎和细胞损伤作用，油酸钠常用于促进脂质蓄积，二者联合使用模拟脂毒性微环境，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

实际使用时，针对不同细胞种类及实验目的，本产品所用浓度不同，一般与培养基总体积按1:60-1:12稀释，终浓度为100-500μmol/L，棕榈酸钠的推荐浓度范围150-250μmol/L，油酸钠的推荐浓度范围为300-500μmol/L。对于首次使用本产品，建议采用浓度梯度处理细胞，摸索针对特定细胞、达到特定效果的适宜浓度。处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24-48小时为宜。

4. 实验内容

在细胞实验的核心部分，研究者系统运用多种细胞模型以确证体内发现的分子通路。为模拟MASLD中的肝细胞脂质超载，实验采用AML12小鼠肝细胞系及原代小鼠肝细胞，给予棕榈酸钠和油酸钠混合物（0.15 mM棕榈酸钠与0.3 mM油酸钠）处理12小时，成功诱导显著的细胞内脂滴堆积。

如图1A与5B所示，与磷酸盐缓冲液（PBS）对照组相比，重组小鼠FGF1（rFGF1，500 ng/mL）处理24小时可大幅减少AML12细胞的油红O染色面积，并显著降低细胞内总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量，证明FGF1直接作用于肝细胞发挥抗脂肪变性功效。在原代肝细胞中亦获得一致结果（图1C与5D），排除了细胞系特异性干扰。为鉴定介导此效应的肝细胞表面受体，研究者通过qPCR分析发现，原代肝细胞中FGFR4表达最为丰富，其次为FGFR2，而HFD喂养后FGFR1、FGFR2及FGFR4的mRNA水平均下降（图1M与5N）。进一步利用泛FGFR抑制剂infigratinib，在棕榈酸钠和油酸钠处理的AML12细胞中完全逆转了rFGF1降低TC与TG的效果（图1O与5P），确认FGFR通路介导FGF1的降脂作用。随后采用各亚型特异性抑制剂（PD166866、FGFR2-IN-1、VSPPLTLGQLLS、FGFR4-IN-1）进行竞争性实验，结果显示仅FGFR4抑制剂可阻断rFGF1的降脂效果，而抑制FGFR1/2/3无显著影响（图1Q与5R），明确FGFR4为FGF1抗脂肪肝功能的主要执行受体。在分子机制层面，rFGF1处理显著下调了脂质合成相关基因Srebp1c、FASN、SCD1、ACC1及PPARγ的表达，并降低脂肪酸转位酶CD36的mRNA水平，但对脂肪酸氧化（PPARα、CPT1α）及脂质输出（ApoB、MTTP）通路无显著改变（图1S），提示FGF1主要通过抑制从头脂质合成与脂肪酸摄取而非促进氧化或分泌来缓解肝细胞脂肪堆积。

图1. FGF1主要通过FGFR4治疗肝脏脂肪变性

在LSEC细胞实验设计中，研究者构建了体外RXRG-FGF1转录调控模型。利用Bend.3细胞系及原代LSEC，RXR激动剂Bexarotene处理呈时间（12-48小时）与剂量（10-50 μM）依赖性地诱导FGF1 mRNA上调（图2G与图2H），而RA处理同样在LSEC中剂量与时间依赖地促进FGF1表达（图2K），提示RA作为RXR内源性配体可直接激活FGF1转录。为排除其他RXR亚型干扰，过表达RXRG可显著增强FGF1启动子驱动的荧光素酶活性，而RXRG siRNA敲低则抑制该活性。ChIP-seq数据（GSE79815）显示RXR在FGF1转录起始位点上游-884 bp处存在结合峰（图2I），ChIP-qPCR进一步验证了内源性RXRG与该区域的结合。

图2. C-Kit和RA通过RXRG-FGF1轴改善肝脏脂肪变性

最关键的实验在于，在c-Kit缺失的LSEC中，RXRG与FGF1表达均下降，而Bexarotene处理可恢复FGF1水平；相反，在Bend.3细胞中过表达c-Kit可上调FGF1，但此效应被RXR拮抗剂UVI 3003完全阻断，确证RXRG处于c-Kit下游，且对FGF1转录激活不可或缺。此外，在棕榈酸钠和油酸钠诱导的脂毒性体系中，条件性敲除LSEC来源的FGF1后，c-Kit阳性LSEC过继转移不再能降低受体小鼠肝细胞脂质含量，而野生型c-Kit阳性LSEC则有效减轻脂肪变性，进一步证明该保护轴依赖于LSEC分泌的FGF1。

5. 总结

本研究首次阐明肝窦内皮细胞（LSEC）空间分区在MASLD早期发病中的核心作用，揭示一条c-Kit/RXRG/FGF1保护性信号轴。研究发现，早期脂肪沉积特异性地始于中央静脉（PC）区，且PC区LSEC高表达的c-Kit在MASLD中显著下调。内皮特异性敲除c-Kit加剧脂肪肝、炎症与纤维化，而回输c-Kit⁺LSEC则能缓解病变。机制上，c-Kit通过维持核受体RXRG的转录活性，驱动下游FGF1表达。FGF1作为旁分泌因子，经肝细胞FGFR4受体抑制脂质从头合成与摄取，从而减轻脂滴堆积。RXRG直接结合FGF1启动子激活其转录，其内源性配体视黄酸（RA）可剂量/时间依赖地上调LSEC中FGF1并改善MASLD。内皮特异性FGF1敲除完全阻断c-Kit⁺LSEC的保护效应，证实该轴因果关系。此外，NHANES数据分析显示膳食维生素A摄入与MASLD风险呈负相关，支持临床转化潜力。该工作将LSEC分区、转录调控与旁分泌作用整合为一条完整通路，为MASLD早期干预提供了新靶点与理论依据。

小编有话说：

高脂细胞添加剂棕榈酸钠与油酸钠在体外成功模拟了MASLD肝细胞脂毒性微环境，是验证FGF1抗脂肪肝功效及FGFR4信号特异性的核心工具。原代细胞与细胞系实验采用如下流程：棕榈酸钠和油酸钠混合物处理12小时诱导脂肪变性，而后给予rFGF1（500 ng/mL，24小时）或相应抑制剂（在SO/SP诱导11小时后，加入抑制剂预处理1小时，再加rFGF1），通过油红O染色及生化定量评估脂质含量。RXR激动剂/拮抗剂实验采用Bexarotene（25 μM，48小时）或UVI 3003（10 μM，2小时预处理）及RA（25 μM，48小时）处理LSEC，结合qPCR与Western blot检测FGF1表达。双荧光素酶报告基因与ChIP-qPCR验证RXRG对FGF1启动子的直接结合。

该研究使用的棕榈酸钠与油酸钠（货号KC006）由鲲创（Kunchuang）公司提供，有效支持了MASLD细胞模型的稳定构建，为靶向肝窦内皮-肝细胞交互的早期干预策略研发奠定了可靠的技术基础。未来，基于该高脂添加剂体系的药物筛选与机制研究将极大受益于其批次稳定性和操作便捷性，有望加速代谢性肝病新型治疗靶点的临床前转化。

参考文献

Fang, Z.; Che, B.; Ling, Y.; Liu, P.; Liu, J.; Song, P.; Yue, Z.; Ruan, B.; Lin, Z.; Xu, H. Liver Endothelial Zonation Orchestrates Hepatic Steatosis Onset through Retinoic Acid–Regulated FGF1. Science Advances 2026, 12 (25). https://doi.org/10.1126/sciadv.aed4384.