Advanced Science（IF/ 14）：多种长链脂肪酸（PA、SA、OA、LA、AA）对肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）活化和癌细胞侵袭的影响研究

1. 研究背景

代谢重编程是肿瘤进展的核心标志之一。在实体瘤微环境中，肿瘤细胞与基质细胞（如癌相关成纤维细胞（CAF）、内皮细胞和免疫细胞）共同构成了复杂的生态系统。脂肪酸是肿瘤微环境中最丰富的营养物质之一，其通过脂肪酸转位酶（CD36）、脂肪酸转运蛋白（FATP）和长链脂酰辅酶A合成酶（ACSL）等转运蛋白进入细胞，充当能量来源和信号分子。近年来，脂肪酸代谢在肿瘤进展中的作用日益受到关注，但基质细胞如何应对脂肪酸胁迫并从中获益的机制尚不清楚。尤为关键的是，尽管肿瘤细胞内在的适应机制已有较多研究，但肿瘤微环境中的基质细胞如何在代谢压力下存活甚至“繁荣”仍是一个未解之谜。这一知识空白限制了我们对肿瘤-基质交互作用的理解，也阻碍了针对基质细胞代谢脆弱性的治疗策略开发。

2. 技术路线

本研究以口腔鳞状细胞癌（OSCC）为模型，综合运用单细胞转录组测序（scRNA-seq）、批量RNA测序（RNA-seq）、靶向切割与标签化（CUT&Tag）表观基因组 profiling、患者来源的成纤维细胞-肿瘤类器官共培养模型以及原位异种移植瘤模型，系统解析了脂肪酸代谢与CAF激活之间的分子联系。研究首先通过临床样本和多组学数据分析锁定CD36为CAF中关键的脂肪酸转运蛋白，继而利用五种OSCC组织中富集的脂肪酸进行功能筛选。在此基础上，通过表观遗传学和转录组学整合分析，揭示CCAAT/增强子结合蛋白γ（CEBPG）介导的增强子激活机制，并利用基因敲除、药理学干预和体内功能验证实验，最终阐明棕榈酸（PA，Palmitic Acid）-CD36-CEBPG-肌醇需求酶1α（IRE1α）/跨膜Bax抑制因子6（TMBIM6）这一完整的信号轴。

3. 高脂细胞添加剂

在体外细胞实验中，使用多种长链脂肪酸（棕榈酸PA、硬脂酸SA、油酸OA、亚油酸LA、花生四烯酸AA）对肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）活化和癌细胞侵袭的影响研究。

本研究中五种长链脂肪酸（PA、SA、OA、LA、AA）及对应钠盐的高脂细胞添加剂均由西安鲲创生物（Kunchuang Biotechnology）提供，对应货号如下：

鲲创高脂细胞添加剂核心优势：1）无菌液体溶液、浓度准确，直接按比例加入细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。2）溶剂无毒，配制过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。3）该添加剂低温无析出、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，能够显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

一般情况下，棕榈酸（钠）可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸（钠）可以用来诱导细胞代谢异常，多种游离脂肪酸组合可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等等。

4. 细胞实验内容

首先通过气相色谱-质谱联用（GC-MS，Gas Chromatography-Mass Spectrometry）对7对OSCC肿瘤及配对癌旁黏膜组织进行了51种中长链脂肪酸的靶向定量检测。结果显示，与癌旁组织相比，OSCC组织中五种长链脂肪酸显著富集，分别是棕榈酸（PA ，Palmitic Acid）、硬脂酸（SA，Stearic Acid）、油酸（OA，Oleic Acid）、亚油酸（LA，Linoleic Acid）和花生四烯酸（AA，Arachidonic Acid）。这一发现为后续的功能筛选提供了生理相关的脂肪酸谱基础。

为了明确哪些脂肪酸能够有效驱动CAF的肌成纤维细胞活化，研究者将上述五种脂肪酸或对应钠盐以相同浓度（200 μM）处理三维培养中的CAF。其中，棕榈酸（钠）和硬脂酸（钠）能够更有效地促进CAF的形态学活化，表现为细胞伸展和星形形态的增强。然而，进一步的细胞毒性评估显示，硬脂酸（钠）的细胞毒性显著高于棕榈酸（钠）。棕榈酸（钠）在有效激活CAF的同时能够支持细胞的长期培养，而硬脂酸（钠）则导致细胞活力快速下降。这一结果与既往文献中棕榈酸（钠）促进OSCC发展的报道相一致。基于上述筛选结果，研究者最终选定棕榈酸（钠）作为后续机制研究的主要脂肪酸。

在确认棕榈酸（钠）为最适激动剂后，研究者系统评估了棕榈酸（钠）对CAF表型的影响。如图1F-I所示，50 μM 棕榈酸（钠）处理显著增强了CAF中纤维状肌动蛋白（F-actin）的荧光强度，表明棕榈酸（钠）促进了细胞骨架的组装。胶原收缩实验进一步证实了棕榈酸（钠）的功能效应：如图1J、K所示，棕榈酸（钠）处理的CAF在24小时内对胶原凝胶的收缩百分比显著高于对照组。在三维基质胶克隆形成实验中，如图1L-N所示，棕榈酸（钠）处理组的CAF克隆直径更大，侵袭前沿数量更多，这些均是肌成纤维细胞活化的典型特征。

图1. 棕榈酸（钠）触发肌细胞内质网应激适应基因的表达

上述棕榈酸（钠）介导的促活化效应依赖于CD36的功能。研究者使用了两种策略来验证这一点：一是CD36特异性抑制剂SSO（50 μM），二是CD36中和抗体FA6-152（0.05 μg/mL）。如图2A-D所示，在类器官共培养模型中，加入SSO或FA6-152后，棕榈酸（钠）诱导的CAF活化被显著抑制，表现为CAF的伸展形态减弱、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达降低。重要的是，对照实验表明棕榈酸（钠）、SSO或FA6-152对单独培养的肿瘤细胞的活力或侵袭能力均无直接影响，排除了这些试剂对肿瘤细胞的直接作用。

图2 CAF中CD36在棕榈酸（钠）诱导的异种原位移植模型转移中的作用

为进一步确证CD36在CAF中的关键作用，研究者利用慢病毒载体在CAF中实现了CD36的稳定敲低（图2E）。在类器官共培养模型中，如图2F-H所示，CD36敲低不仅损害了CAF的活化，还减少了肿瘤细胞的侵袭面积和侵袭前沿数量。在体内原位移植瘤模型中（图2I），棕榈酸（钠）加速了舌部移植瘤的形成（第6天3/5 vs 0/5），而CAF中CD36的敲低完全消除了这一效应（图2J）。第14天的分析显示，棕榈酸（钠）增加了肿瘤体积和颈部淋巴结转移体积，而CD36敲低则逆转了这些效应（图2K、L）。免疫组织化学（IHC）分析进一步证实，CD36敲低削弱了棕榈酸（钠）介导的胶原沉积（图2M-P），表明CD36介导的棕榈酸（钠）摄取增强了CAF的细胞外基质重塑能力。组织学分析和人源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的实时荧光定量PCR（qPCR）检测表明，棕榈酸（钠）显著促进了淋巴结转移（5/5 vs 1/5），而CD36敲低则消除了这一促进作用（图2Q、R，图S5D-F）。三重染色细胞角蛋白5/6（CK5/6）、增殖标志物Ki67和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）证实这些转移灶形成了具有增殖活性的肿瘤细胞团簇。

在机制层面，研究者通过RNA-seq分析发现棕榈酸（钠）处理上调了内质网应激适应相关基因（图1O）。qPCR验证表明棕榈酸（钠）促进了热休克蛋白A5（HSPA5）、DNA损伤诱导转录因子3（DDIT3）和内质网至细胞核信号传导1（ERN1，编码IRE1α）等多个内质网应激适应基因的转录，而CD36的药物抑制则逆转了这一效应（图1Q）。在转录因子层面，如图1R所示，CEBP家族蛋白在棕榈酸（钠）处理后广泛上调，其中CEBPG是唯一在两个CAF株系中均上调的成员。蛋白质印迹（Western blot）和qPCR证实棕榈酸（钠）促进了CEBPG的表达（图1T）。

通过CUT&Tag表观基因组 profiling，研究者鉴定了棕榈酸（钠）处理后组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）修饰增强的增强子区域。如图3A-C所示，整合RNA-seq和CUT&Tag数据，共鉴定出47个在转录和表观遗传层面协同上调的基因，其中ERN1和TMBIM6是两个关键的内质网应激调控因子。如图3D所示，棕榈酸（钠）处理显著增加了ERN1增强子（chr17:64,082,903-64,081,889）和TMBIM6增强子（chr12:49,750,298-49,750,744）处组蛋白H3第4位赖氨酸单甲基化（H3K4me1）和H3K27ac的占有率。HOMER基序分析显示棕榈酸（钠）上调的增强子区域显著富集CEBP家族结合基序（图3E）。CEBPG敲低后，棕榈酸（钠）诱导的ERN1和TMBIM6上调被显著抑制（图3F-H）。双荧光素酶报告基因实验进一步鉴定了功能性CEBPG结合位点：ERN1增强子的P3位点（397-406 bp）和TMBIM6增强子的P1位点（284-293 bp）（图3I-M）。靶向切割与核酸酶释放-定量PCR（CUT&RUN-qPCR）证实棕榈酸（钠）处理增强了CEBPG在这些增强子上的富集（图3N-Q）。

功能验证实验表明，TMBIM6敲低和IRE1α抑制剂KIRA6（1 μM）均显著损害CAF介导的胶原收缩。在类器官共培养中，联合抑制TMBIM6和IRE1α显著减少了肿瘤细胞的侵袭面积和侵袭前沿数量。ERN1敲低产生了与KIRA6相当的抑制效果。CEBPG敲低同样削弱了CAF的胶原收缩和促侵袭能力，而TMBIM6过表达或IRE1α激动剂IXA4（10 μM）则可部分恢复这些功能缺陷。流式细胞术显示，棕榈酸（钠）处理4天后，TMBIM6敲低或IRE1α抑制均增加了CAF的早期凋亡（膜联蛋白V阳性/碘化丙啶阴性细胞群）。

图3  CEBPG通过增强子激活调控ERN1和TMBIM6的转录

5. 总结

脂肪酸(FAs)在多种癌症中创造了促进转移的生态位，但肿瘤微环境(TME)如何抵消FA压力仍不清楚。在此，我们发现FA转运蛋白CD36在肌成纤维细胞癌相关成纤维细胞中表达上调，它与口腔鳞状细胞癌的转移有关。在口腔鳞状细胞癌组织中丰富的五种主要FA物种中，棕榈酸(钠)有效地激活了2D、3D和有机类共培养模型中的myoCAF表型。在体内，棕榈酸(钠)促进由口腔鳞状细胞癌细胞和CAF组成的原位肿瘤的淋巴转移，这种作用被癌症相关成纤维细胞(CAF)中的CD36基因敲除而取消。从机制上讲，棕榈酸(钠)重塑了染色质的格局，以增加H3K27ac在多个基因上的占有率，包括ERN1和TMBIM6，两个压力适应调节基因。CAF中ERN1和TMBIM6的转录受CCAAT/增强子结合蛋白γ以增强子相关的方式调控。破坏CEBPG-IRE1α/TMBIM6轴可减弱MyoCAF的特性，并消除棕榈酸(钠)驱动的转移。最终的结果揭示了间质代谢检查点，并建立了CEBPG介导的应激恢复能力作为减少转移的治疗目标。意义：棕榈酸通过基质CEBPG-IRE1α/TMBIM6轴促进转移，揭示了一种代谢脆弱性，为抑制口腔鳞状细胞癌提供了新的治疗靶点。

小编有话说：

这篇发表在 Advanced Science（IF 14）上的研究之所以扎实，不仅因为信号轴梳理得干净利落，更因为它在每个关键节点上都做了排他性验证——五种脂肪酸逐一筛选、多种转运蛋白中唯独锁定 CD36、CEBP 家族中只有 CEBPG 在两个株系中一致上调。对做脂肪酸代谢或 CAF 方向的课题组来说，这套实验设计范式本身就很有参考价值。

文中所有脂肪酸处理均严格遵循制造商的protocol，在完全培养基中进行，处理时间为24-48小时。西安鲲创（Kunchuang Biotechnology）提供的系列高纯度脂肪酸为肿瘤代谢微环境研究提供了可靠的工具化合物，其产品纯度和批次稳定性保障了体外功能筛选和机制研究的可重复性，是探索脂肪酸代谢与肿瘤进展关系的理想选择。

此外，鲲创科技还接受特殊浓度和特殊产品的定制工作，例如：即溶型二十二碳六烯酸（DHA ）、即溶型二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳五烯酸（DPA）、二十碳三烯酸（EDA）等超长链脂肪酸添加剂。

参考文献

Duan, Y.; Li, Y.; Wu, Y.; Yang, X.; Li, R.; Zhao, H.; Shang, Z. CEBPG‐Mediated Palmitic Acid Adaptation of Cancer‐Associated Fibroblasts Drives Metastasis of Oral Squamous Cell Carcinoma. Advanced Science 2026. https://doi.org/10.1002/advs.75875.