CMBL（IF 10.2）：棕榈酸模拟体外高脂微环境处理TM3小鼠Leydig细胞系建立体外高脂细胞模型

1. 研究背景

近年来，高脂饮食（HFD）消费的全球化趋势日益显著，其与代谢综合征、慢性炎症及生殖功能障碍的关联备受关注。男性睾酮合成主要依赖于睾丸间质中的Leydig细胞（LCs），该过程具有高度的亚细胞空间协调性：胆固醇首先在线粒体内膜由CYP11A1催化为孕烯醇酮，随后转运至内质网（ER）经多步酶促反应生成睾酮。因此，线粒体与内质网之间的物理耦联——即线粒体-内质网接触（MERCs）——构成了睾酮合成的结构基础。MERCs由IP₃R-Grp75-VDAC等蛋白复合体锚定，间距仅10–30 nm，不仅介导Ca²⁺信号传递，还调控脂质转运与能量代谢。然而，HFD如何通过干扰MERCs损害LC功能，其早期分子事件尚不明确。

传统研究多聚焦于单一细胞器（如线粒体或ER）的功能异常，忽视了细胞器间互作网络的系统性改变。近年来，单细胞转录组测序（scRNA-seq）与蛋白质组学技术的进步，为揭示细胞异质性及亚细胞结构动态提供了有力工具。本研究即利用GEO数据库公开的HFD小鼠睾丸scRNA-seq数据（GSE239391），结合流式细胞分选、透射电镜、免疫荧光及脂滴蛋白质组学，系统解析了HFD对LCs中MERCs的影响。此外，乙酰辅酶A羧化酶（ACC）抑制剂Firsocostat被用于干预脂滴（LDs）合成，以验证LDs在MERCs调控中的核心地位。这一技术框架突破了单一细胞器研究的局限，从细胞器互作网络的角度重新审视了代谢应激对生殖内分泌的损害机制。

2. 技术路线

本研究的技术路线分为四个层次：首先，通过scRNA-seq数据分析HFD小鼠睾丸中各类细胞的数量变化及MERCs相关基因表达谱，发现LCs中VDAC1、VDAC2、HSPA9等关键基因显著下调；其次，利用流式细胞分选富集原代LCs，结合透射电镜（TEM）直接观察MERCs超微结构，并辅以免疫荧光共定位验证VDAC1与StAR的空间邻近性；第三，采用TM3小鼠LC系进行体外高脂建模（棕榈酸PA处理），通过Western blot、免疫荧光及流式细胞术检测细胞骨架（F-actin/G-actin）、线粒体膜电位（TMRE）、ROS（MitoSOX）及ER应激标志物（Bip/CHOP），明确LDs对肌动蛋白动态平衡的干扰；最后，通过体内外给予ACC抑制剂Firsocostat，评估抑制LD合成对MERCs恢复及睾酮合成能力的挽救效果。整体路线从“现象→机制→干预”层层递进，逻辑严密。

3. 高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，使用棕榈酸作为高脂细胞添加剂处理TM3小鼠Leydig细胞系，棕榈酸能够显著抑制睾酮合成限速酶（Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1）的mRNA表达，并诱导LDs在胞内大量积聚。

该棕榈酸高脂细胞添加剂（货号KC003）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸和溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的棕榈酸相比，具有溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶、浓度准确、能够呈现清晰的剂量依赖性趋势等显著优势。

需要说明的是，棕榈酸能够模拟脂毒性微环境，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等炎症和损伤。

实际使用时，针对不同细胞种类及实验目的，本产品所用浓度不同，一般与培养基总体积按1:60-1:12稀释，终浓度为100-500μmol/L，棕榈酸的推荐浓度范围200-350μmol/L。对于首次使用本产品，建议采用浓度梯度处理细胞，摸索针对特定细胞、达到特定效果的适宜浓度。处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24-48小时为宜。

4. 实验内容

1）高脂细胞模型的建立与验证

本研究选用TM3小鼠Leydig细胞系作为体外模型，因其在形态学和功能上均具有原代LCs的代表性。为模拟体内高脂环境，细胞被暴露于300 µM棕榈酸（PA，产品编号KC003，购自Kunchuang Biotechnology）中，该浓度参照文献报道的饱和脂肪酸负荷模型，可有效诱导脂毒性而维持细胞存活率。首先，按照产品说明书，将PA储备液直接用完全培养基稀释至终浓度300μmol/L，处理时间为24小时。为验证模型有效性，研究者首先检测了睾酮合成关键酶的表达变化。数据显示，PA处理后Star、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd3b1的mRNA水平均显著下调（P<0.01），与体内HFD小鼠数据一致，证实PA能够模拟高脂饮食对LCs的抑制效应。进一步地，实验中的TEM图像清晰显示PA处理细胞胞浆内出现大量电子致密的圆形脂滴结构，印证了脂质超载的诱导成功。

2）脂滴积聚对细胞骨架的选择性破坏

研究团队关注到细胞骨架在MERCs维持中的机械支撑作用，因此系统分析了PA对三类主要骨架组分的影响。图1A–B展示了免疫荧光染色结果：对照组F-actin（绿色荧光，鬼笔环肽标记）呈现均匀的细胞边缘分布，而PA处理后F-actin信号变得斑驳、局部凝聚且总体荧光强度显著降低；相比之下，微管蛋白α-Tubulin（品红色）和中间丝蛋白Nestin（红色）的分布及强度均无明显改变。图1C–D的Western blot定量进一步证实，PA处理使F-actin蛋白水平下降约40%（P<0.01），而α-Tubulin和Nestin无统计学差异。更为关键的是，图1E–F显示G-actin（单体肌动蛋白）在PA组也显著减少（P<0.001），且G-actin/F-actin比值降低，提示高脂条件不仅破坏已有微丝网络，还减少了肌动蛋白单体池的可利用性，从而阻碍微丝的动态更新。这种双向耗竭对细胞骨架的动态平衡构成了沉重打击。同时，图1G借助单细胞转录组数据展示了HFD小鼠原代LCs中与肌动蛋白动态相关基因（如Wdr1、Gsn、Cfl1、Actr2等）的表达下调，从体内角度佐证了上述发现。

图1. 高脂水平会减少LC中的F-肌动蛋白，导致MERCs减少

3）细胞骨架紊乱导致MERCs结构解体

为直观评估F-actin减少对Mito-ER空间关系的影响，研究者在图1H中进行了三重免疫荧光共定位：F-actin（绿色）、线粒体外膜蛋白Tom20（红色）和内质网标志物PDI（品红色）。在对照组中，Tom20和PDI信号高度重叠（共定位系数约0.7），且这种重叠区域与F-actin纤维的走行方向一致，提示微丝可能作为“导轨”将两种细胞器锚定在近距离范围内。PA处理后，Tom20和PDI的共定位系数降至0.3以下（图1I），同时F-actin信号强度下降约60%（图1J）。这一结果与TEM观察（图2E–F）互为补充：在TEM下，对照组LCs中线粒体外膜与ER膜间距普遍小于50 nm，符合“有效接触”定义（<100 nm）；而PA组间距显著增大至150–200 nm（P<0.001），且接触位点的电子密度降低，提示锚定蛋白复合体可能已解离。值得注意的是，尽管补充图显示PA组线粒体出现嵴断裂、基质空泡化等退行性改变，但线粒体数量未减少，说明结构破坏先于细胞死亡。

图2. 脂滴导致G-肌动蛋白减少

图3. 通过抑制LD合成促进睾酮生成，增强线粒体和内质网功能

4）脂滴与G-actin的负调控关系

图2A–B中，BODIPY（绿色）与StAR（红色）共染显示HFD小鼠睾丸间质中存在大量LDs堆积，且与StAR阳性区域高度重叠，提示LDs直接定位于LCs胞内，流式分选后，TEM定量（图2C）证实HFD组每个LC平均含12.5个LDs，而对照组仅2.3个（P<0.001）。为探索LDs如何影响肌动蛋白，研究者进行了脂滴蛋白质组学（图2D–E），从分选的原代LCs中提取LDs并进行质谱鉴定，共检出326种LD特异性蛋白。GO富集分析（图2F，左侧）显示这些蛋白显著富集于“肌动蛋白丝组织”和“超分子纤维组织调控”等条目，KEGG通路（右侧）则指向“肌动蛋白细胞骨架调控”通路。图2G构建了该通路中关键蛋白（如Actr2/3复合物亚基、Cfl1、Pak3等）的相互作用网络，进一步提示LDs可能通过隔离或修饰这些调控因子影响G-actin的稳定性。为验证该假说，图2H–I显示PA处理组中BODIPY阳性LDs（绿色）与G-actin（品红色）免疫荧光共定位区域减少，且G-actin总荧光强度下降约55%（P<0.001）。这支持了“LDs通过消耗胞质G-actin池，削弱微丝聚合能力”的机制模型。

5）线粒体功能与ER应激的级联响应

MERCs解体引发了下游一系列细胞器功能紊乱。实验数据显示，JC-1流式细胞术检测显示PA组线粒体膜电位（ΔΨm）显著下降（红/绿荧光比值降低约50%），进一步揭示NADPH和ATP含量分别减少35%和42%（P<0.01），表明能量代谢受损。使用MitoSOX探针检测线粒体超氧化物，PA组荧光强度升高2.3倍（P<0.001），提示氧化应激爆发。在ER方面，Western blot显示PA组Bip（GRP78）和CHOP蛋白上调约2倍，Nrf2亦被激活（P<0.05），通过qPCR证实三条ER应激分支通路（Hspa5/Atf4、Xbp1、Atf6）均被显著诱导（P<0.01）。

值得注意的是，当使用Firsocostat阻断脂滴合成后（图3A–B），G-actin和F-actin水平均恢复至接近对照水平，图3C–D中COX2（线粒体）与PDI（ER）的共定位系数从0.28回升至0.61（P<0.01），图3E–F中TMRE荧光强度也显著改善（P<0.001），图3G–H显示Bip和CHOP表达回落。最终，图3I–J中StAR、CYP11A1、3β-HSD的免疫荧光强度均增强（P<0.05），表明功能恢复。

5. 总结

近年来，生殖系统疾病的发病率一直在稳步上升。此外，随着生活水平的提高，代谢性疾病的发病率也逐渐增加。然而，生殖性疾病和代谢性疾病之间的联系和机制并不明确。利用已发表的单细胞RNA测序数据，分析线粒体-内质网（ER）接触（MERCS）基因在细胞器连接性中的表达。采用基于质谱的蛋白质组学分析脂滴（LDs）与肌动蛋白细胞骨架之间的联系。通过流式细胞术分选结合透射电镜，我们探索了LD介导的线粒体-内质网接触。在高脂饮食（HFD）小鼠中，许多Mercs相关基因的表达减少，同时，间质细胞（LCs）减少。机制上，LDs下调G-肌动蛋白的表达，导致线粒体与内质网分离。从功能角度看，脂肪生成酶乙酰-辅酶A羧化酶（ACC）抑制剂Firsocostat可抑制LD的合成，缩短线粒体与内质网之间的距离，改善线粒体功能，促进睾酮合成。最后，靶向LDs为改善高脂条件下的LC功能，从而保护睾丸内分泌功能提供了一种有前景的改善策略。HFD通过破坏脂滴介导的线粒体接触而导致生殖功能障碍。

小编有话说：

本研究中高脂细胞添加剂KC003棕榈酸（Kunchuang Biotechnology）以300 µM浓度处理TM3细胞24小时，成功模拟了体内HFD诱导的脂滴积聚、肌动蛋白动态失衡、MERCs解离及线粒体-内质网双重功能障碍，最终抑制睾酮合成。该模型稳定可靠，重复性高，是研究脂毒性对生殖细胞影响的理想工具。Material and Methods中明确规定了PA的浓度、处理时长（24 h）及Firsocostat共处理方案（70 mM，48 h），确保了实验的可溯源性。值得强调的是，本研究首次从“脂滴-肌动蛋白-MERCs”轴阐明了高脂损害LC功能的分子机制，打破了传统上单一细胞器研究的局限。KC003棕榈酸作为高品质脂肪酸标准品，不仅适用于生殖毒理学研究，还可拓展至肝细胞、胰岛β细胞及心肌细胞等代谢活跃细胞类型的脂毒性建模，为探索脂代谢相关疾病的早期干预提供坚实基础。Kunchuang Biotechnology深耕细胞生物学工具领域，产品纯度高、批次稳定性强，是助力科研人员揭示脂代谢网络调控规律的可靠伙伴。

参考文献

Sun, L.; Wang, A.; Zhang, Y.; Chen, J.; Huang, P.; Zeng, K.; Huang, S.; Huang, J.; Luo, J.; Wang, J. High-Fat Diet Leads to Male Reproductive Dysfunction by Disrupting Lipid-Droplet-Mediated Organelle Crosstalk. CELLULAR & MOLECULAR BIOLOGY LETTERS 2026. https://doi.org/10.1186/s11658-026-00891-2.