Huh 7、HepG2、AML 12、原代肝细胞高脂细胞模型建立方法（细胞脂毒性模型）
本文采用300μmol/L棕榈酸钠溶液（货号KC001）处理原代肝细胞，两种人肝细胞系-Huh7和HepG2以及小鼠肝细胞系-AML12，36小时后，成功建立肝细胞高脂细胞模型（细胞脂毒性模型），基于该模型添加他莫昔芬（10、20、40μM），实验数据共同表明他莫昔芬可以有效地保护肝细胞免受体外脂毒性，而不增加细胞毒性，并以JNK/MAPK信号传导依赖性方式改善NAFLD。如果联合使用油酸钠来诱导NAFLD细胞模型，一般建议采用的浓度比为油酸钠:棕榈酸钠=2:1（货号KC006），处理时间2-3天，效果会更好、且更加稳定。
Huh 7、HepG2、AML 12、原代肝细胞高脂细胞模型建立方法（细胞脂毒性模型）
Signal Transduction and Targeted Therapy（IF= 40.8）
1. 前言
非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种代谢相关的慢性肝脏疾病，在西方国家已成为肝细胞癌的主要病因和肝移植的主要原因。在病理学特征方面，NAFLD可分为非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎（NASH），NASH易发生终末期脂肪肝。NAFLD的发病机制复杂，与肥胖、2型糖尿病、高脂血症和代谢综合征密切相关。尽管疾病负担在增加，但迄今为止尚未发现FDA批准的药物可有效治疗NAFLD或NASH。
他莫昔芬于1966年合成，是一种选择性雌激素受体（ER）调节剂（SERM）。一些体外和体内实验证明，他莫昔芬促进肝细胞中的脂质积累并增强脂肪酸生物合成。然而，一些其他发现表明，他莫昔芬保护肝细胞免受脂毒性和脂肪变性。为了探索他莫昔芬对肝细胞的影响，本文利用原代肝细胞，两种人肝细胞系-Huh 7和HepG 2以及小鼠肝细胞系-AML 12构建体外高脂细胞模型，以验证他莫昔芬以JNK/MAPK信号传导依赖性方式改善NAFLD。
2. 游离脂肪酸FFAs
游离脂肪酸FFAs为西安鲲创科技发展有限公司（Kunchuang Biotechnology，Xi’an，China）的高脂细胞添加剂（棕榈酸钠）（货号KC001），高脂细胞添加剂为液体即用型，具有溶剂无毒、常温无析出、浓度精准，无需多次加热助溶等特点。实际使用时，只需要将试剂按照比例加入到完全培养基中即可。
3. 细胞培养
细胞系获自中国科学院细胞库（中国上海）。Huh7和HepG2细胞系在补充有10%胎牛血清（FBS）和100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素或高葡萄糖DMEM培养基中生长。使AML12细胞系在补充有10% FBS、1% ITS液体培养基补充物和40ng/ml地塞米松的DMEM：F12培养基中生长。
将所有细胞系保持在37°C和5% CO2的加湿培养箱中。在每个实验中使用第三代至第十代的细胞。从8周龄雄性C57BL/6小鼠中分离原代肝细胞，并在HM培养基中培养，然后以1×106/孔接种在6孔板中。为了诱导细胞脂毒性，将0.3mM棕榈酸钠溶液（KC001，Kunchuang Biotechnology，Xi'an，China）加入培养基中，并加入载体作为对照。36h后，以10、20、40μM的剂量加入溶于DMSO的他莫昔芬并保持36h，加入DMSO作为对照。为了在体外诱导JNK活化，在他莫昔芬处理前2小时加入茴香霉素（10μM）。
为了在体外抑制JNK磷酸化，在他莫昔芬处理前2小时加入30μM Tanzisertib（cc-930）。对于细胞油红O（ORO）染色，将细胞在六孔板中培养，并在棕榈酸钠和他莫昔芬处理后，除去培养基，并用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，并用PBS洗涤三次。然后用60%异丙醇处理细胞5min。去除异丙醇，用ORO工作液染色细胞10分钟，并用PBS洗涤细胞。然后将细胞用苏木精染色3-5分钟，并用PBS洗涤至少三次。然后，我们使用倒置相差显微镜观察并拍照。对于细胞TC和TG测试，采用商业试剂盒并遵循制造商的说明。
4. 细胞处理与结果
为了诱导脂毒性，将细胞暴露于0.3 mM棕榈酸钠溶液36 h。处理时，在细胞培养基中加入不同浓度的他莫昔芬（10、20、40 μM），继续培养36 h。如油红O（ORO）染色所示（图1a，B），在原代肝细胞和所有三种细胞系中，他莫昔芬可以剂量依赖性方式显著降低棕榈酸钠触发的脂质蓄积。然而，他莫昔芬处理没有降低细胞的TC含量，也没有改变HepG 2细胞系的TG含量。
为了研究他莫昔芬是否增加细胞毒性，我们在用PA加不同浓度的TAM处理的Huh 7和AML 12细胞系中进行染色，以检查细胞活力，发现他莫昔芬处理不增加细胞毒性（补充图S1 a，B）。为了研究他莫昔芬对脂质代谢的作用，我们进行了RT-qPCR实验，发现他莫昔芬以剂量依赖性方式抑制了与脂质摄取（FATP 2、FATP 5和CD 36）、新生脂肪生成（SREBP 1c、FAT 3、SCD 1和ACC 1）、脂肪酸氧化（PPARα、CPT 1 α和ACOX 1）和TG输出（APOB和MTTP）相关的基因表达（补充图S1 c）。这些数据共同表明，他莫昔芬可以有效地保护肝细胞免受体外脂毒性，而不增加细胞毒性。
图1他莫昔芬降低体外肝细胞脂毒性。a将Huh7、HepG2、AML12细胞和原代肝细胞接种在六孔板中。12小时后，向培养基中加入0.3mM棕榈酸钠，36小时后，加入DMSO/他莫昔芬（10、20、40μM）。36小时后，将细胞用ORO染色，使用倒置相差显微镜拍照，并通过ORO染色面积定量。刻度条：100μm。BORO染色的统计分析。对于细胞TC和TG测试，用胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗涤并使用离心机收集。根据制造商的方案进行以下步骤。所有实验重复至少三次生物学时间。
实际操作时，建议待细胞生长至80-100%汇合度时，换成新鲜的含血清、含双抗（10% FBS、1% P/S）的完全培养基，按上述浓度滴加高脂细胞添加剂，对照组加入等量溶剂对照，试剂轻柔地加入到细胞培养皿中，避免局部高浓度试剂损伤细胞，混匀后将细胞放入细胞孵箱中继续培养。此外，上述作用浓度可能会因加药时的细胞密度、代数、状态或耐药性的不同而有所区别。因此，建议具体实验中，先通过浓度、时间梯度实验，寻找出适合于所用细胞的最佳药物作用浓度和最佳作用时间，一般建议作用48-72小时。
小编有话说：
本文采用300μmol/L棕榈酸钠溶液（货号KC001）处理原代肝细胞，两种人肝细胞系-Huh7和HepG2以及小鼠肝细胞系-AML12，36小时后，成功建立肝细胞高脂细胞模型（细胞脂毒性模型），基于该模型添加他莫昔芬（10、20、40μM），实验数据共同表明他莫昔芬可以有效地保护肝细胞免受体外脂毒性，而不增加细胞毒性，并以JNK/MAPK信号传导依赖性方式改善NAFLD。如果联合使用油酸钠来诱导NAFLD细胞模型，一般建议采用的浓度比为油酸钠:棕榈酸钠=2:1（货号KC006），处理时间2-3天，效果会更好、且更加稳定。
参考文献
Zhiqiang Fang, Hao Xu, Juanli Duan, et al. Short-term tamoxifen administration improves hepatic steatosis and glucose intolerance through JNK/MAPK in mice [J]. Signal Transduction and Targeted Therapy.
