JCRQ1（IF/10）：高糖高脂刺激巨噬细胞（RAW 264.7、THP-1、BMDM）与心肌细胞（AC16、H9c2、NRVMs）共培养体系以研究糖尿病心肌病（DCM）

JCRQ1（IF/10）：高糖高脂刺激巨噬细胞（RAW 264.7、THP-1、BMDM）与心肌细胞（AC16、H9c2、NRVMs）共培养体系以研究糖尿病心肌病（DCM）

International Journal of Biological Sciences

1. 前言

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病的重要心血管并发症，以心脏功能进行性恶化为特征，其发病机制涉及慢性炎症、线粒体功能障碍和免疫细胞浸润等多个方面。巨噬细胞与心肌细胞的交互作用在此过程中扮演关键角色。S100A9（钙结合蛋白A9）作为一种损伤相关分子模式（DAMP）蛋白，主要在髓系细胞中表达，参与炎症反应和组织损伤，但其在DCM中的作用尚未明确。本研究通过多组学分析和功能实验，首次系统揭示了巨噬细胞来源的S100A9通过激活STAT3信号通路，扰乱线粒体质量控制，从而促进DCM的进展。

本研究整合生物信息学分析、多种糖尿病小鼠模型（STZ/HFD和db/db）、细胞分子生物学实验及药物干预手段，系统性验证了S100A9在DCM中的作用及其机制。技术上采用包括单细胞测序、蛋白质组学、转录因子活性筛选、基因敲除与过表达、线粒体功能检测等多层次实验策略。

细胞实验聚焦于巨噬细胞（THP-1、BMDM）与心肌细胞（AC16、NRVMs）的交互作用。通过高糖（33 mM）、棕榈酸（PA）、炎性因子（IL-6/TNFα/IFNγ）等刺激，结合S100A9敲低（siRNA）、重组蛋白（rhS100A9）处理和共培养体系，检测S100A9表达与分泌的动态变化。同时，利用STAT3突变体（Y705F）和抑制剂（paquinimod）验证其对线粒体分裂蛋白（DRP1/MFF）的转录调控，并通过免疫荧光、Western blot、转录因子阵列分析STAT3活化机制。

2. 高脂细胞添加剂

文中采用棕榈酸（PA）作为高脂细胞添加剂（现货号KC006，Kunchuang Biotechnology, Xi’an, China.）联合高糖刺激巨噬细胞（RAW264.7、THP-1、BMDM）与心肌细胞（AC16、H9C2、NRVMs）共培养体系以研究糖尿病心肌病（DCM）。

该试剂（KC006）包括了独立包装的6mmol/L棕榈酸钠和12mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。其中，棕榈酸钠可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸钠可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸钠和油酸钠可以单独使用，也可以联合使用。

3.细胞处理及部分实验结果

通过单细胞转录组分析（图1e–g），发现糖尿病心脏中心肌细胞和巨噬细胞均高表达S100A9，且免疫荧光显示其与α-actinin（心肌细胞标志物）和CD11b（髓系细胞标志物）共定位（图1i）。在高糖、棕榈酸（PA）、AGEs等应激条件下，AC16和NRVMs中S100A9表达显著上升（图1j）。此外，巨噬细胞在基础和高糖刺激下S100A9分泌水平远高于心肌细胞，共培养实验进一步证实巨噬细胞是S100A9的主要来源（图1k–l）。

图1  S100A9在糖尿病心脏中表达上调

此外，共培养实验揭示巨噬细胞源性S100A9可反向激活心肌细胞内的S100A9表达。当THP-1巨噬细胞中S100A9被敲低后，共培养上清液的S100A9水平下降，同时心肌细胞的S100A9表达同步减少，证实巨噬细胞通过旁分泌途径调控心肌细胞炎症状态。这一结果在糖尿病小鼠BMDM条件培养基处理的心肌细胞中得到复现，凸显了细胞间交互的地位。

蛋白质组学分析显示，S100A9处理后的AC16细胞中STAT3通路显著富集（图2c），转录因子活性筛选实验明确STAT3是其下游分子（图2e）。免疫印迹和免疫荧光结果显示，S100A9可诱导STAT3 Tyr705位点磷酸化并促进其核转位（图2g–j）。

图2  S100A9激活心肌细胞中的STAT3

进一步机制研究表明，S100A9通过促进STIP1与STAT3的结合，增强STAT3活性，进而调控线粒体分裂蛋白DRP1、FIS1和MFF的表达，导致线粒体过度分裂、膜电位下降和线粒体自噬流受阻。STAT3突变体或敲低可逆转上述效应，而S100A9抑制剂paquinimod则可恢复线粒体形态和功能。研究发现rhS100A9处理的AC16心肌细胞出现线粒体过度分裂（线粒体碎片化）、膜电位下降及线粒体活性氧（mtROS）积累（证据来自透射电镜及MitoTracker成像）。这些变化伴随线粒体自噬流（mitophagy）的抑制，表现为mito-Keima荧光探针的550nm/440nm比值下降。通过转录因子阵列分析，发现STAT3是S100A9下游的关键激活因子，且STAT3磷酸化（Tyr705）在rhS100A9刺激后显著增强。为验证其必要性，研究采用STAT3突变体（Y705F）或siRNA敲低STAT3，成功阻断了S100A9对线粒体分裂蛋白（MFF/FIS1）的转录激活（荧光素酶报告基因实验），并逆转了线粒体功能障碍。

最后，免疫共沉淀（IP）及质谱（IP-MS）实验进一步揭示STAT3与分子伴侣STIP1的相互作用，而S100A9通过增强STAT3-STIP1复合物形成促进STAT3核转位。通过蛋白-蛋白对接模拟（ZDOCK算法），发现STAT3与STIP1的结合界面包含多个功能残基（如STAT3的DNA结合域），为靶向干预提供了结构基础。

4.总结

巨噬细胞-心肌细胞串扰作为糖尿病心肌病（DCM）的潜在干预靶点仍有待深入的探索。单细胞分析发现S100A9作为一种免疫炎症介质，在糖尿病心脏的心肌细胞和巨噬细胞中表达上调。此外，糖尿病小鼠外周血和心脏中F4/80+CCR2+S100A9+巨噬细胞均增加。帕奎莫特或巨噬细胞耗竭(氯屈磷酸钠)阻断S100A9可减轻糖尿病心功能障碍、炎性巨噬细胞浸润、血清促炎细胞因子。更重要的是，巨噬细胞特异性S100A9基因敲除（S100A9/Flox/Lyz2-Cre）可以抑制糖尿病心功能障碍、心肌重构和炎症。S100A9激活导致线粒体过度分裂，线粒体吞噬通量降低，线粒体氧化应激增加。此外，蛋白质组学和转录因子谱阵列揭示了S100A9激活的STAT3在心肌细胞中的作用。然而，这些影响可被STAT3(Y705F)突变、STAT3基因敲除或帕奎莫特缓解。我们的研究强调，巨噬细胞来源的S100A9是糖尿病心功能不全中线粒体质量控制受损的关键介质，靶向S100A9是一个有希望的治疗靶点。

小编有话说：

棕榈酸（PA）作为高脂诱导剂，在细胞模型中模拟糖尿病代谢应激状态，显著上调巨噬细胞和心肌细胞的S100A9表达。棕榈酸（PA）联合高糖处理可协同激活炎症通路，为研究脂毒性在DCM中的作用提供了可靠模型。细胞培养体系中，棕榈酸（PA）的稳定性和可溶解性是实验结果可重复性的关键，需选用高纯度试剂以确保无内毒素干扰。本研究使用的棕榈酸（货号KC006，Kunchuang Biotechnology）能够精准模拟病理环境，助力炎症-代谢交互机制的深入探索，其高纯度和低内毒素等优点保障了实验数据的可靠性。在未来，基于高脂细胞模型将继续为S100A9靶向治疗提供筛选平台，推动转化医学研究。

参考文献

Huo, Shengqi, et al. "Macrophage-derived S100A9 promotes diabetic cardiomyopathy by disturbing mitochondrial quality control via STAT3 activation". International Journal of Biological Sciences,vol.21,2025,pp.3061-3080,https://doi.org/10.7150/ijbs.111128.