高脂细胞添加剂处理肝细胞（SK-Hep1、HepaRG）构建体外脂肪变性模型

1. 技术路线

本文聚焦于代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的发病机制，尤其关注胰岛素抵抗（IR）在其中扮演的核心角色。MASLD作为全球高发的慢性肝病，其病理过程涉及肝脏脂质代谢紊乱、炎症反应及多种细胞类型的相互作用。近年来，鞘糖脂（GSL）代谢通路在代谢性疾病中的作用日益受到重视，其中UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶（UGCG）作为GSL合成的限速酶，被认为是调控胰岛素信号通路的关键分子。尽管以往研究多集中于肝实质细胞（HC），本研究发现UGCG在肝窦内皮细胞（LSEC）中特异性高表达，并在高脂饮食（HFD）诱导的MASLD模型中显著上调，提示LSEC可能是UGCG介导代谢紊乱的主要场所。LSEC作为肝脏微环境中的重要组成部分，其窗孔结构和分泌功能对维持肝脏稳态具有至关重要的作用，其功能障碍与IR及脂肪变性密切相关。

本研究采用CRISPR/Cas9技术构建了LSEC特异性敲除Ugcg的小鼠模型，并通过高脂饮食诱导MASLD，系统评估了基因敲除对体重、肝脂积累、胰岛素敏感性及LSEC稳态的影响。在细胞实验方面，研究首先通过转录组和蛋白质组分析确认UGCG在LSEC中高表达，并利用免疫荧光和Western blot验证其定位。随后，利用原代分选的LSEC和肝细胞进行共培养及条件培养基处理实验，探讨LSEC中UGCG缺失对肝细胞脂质合成的影响。此外，采用人肝癌细胞系构建体外脂肪变性模型，通过UGCG抑制剂处理和外源性GM3添加，明确GM3在胰岛素受体表达调控中的作用。细胞实验还包括扫描电镜观察LSEC窗孔结构、ELISA检测NO/ET-1分泌水平以及油红O染色评估脂滴积累，全面解析细胞间通讯在MASLD进展中的功能。

2. 高脂细胞添加剂

在体外模型中，研究采用油酸（钠）和棕榈酸（钠）以2:1比例混合作为游离脂肪酸（FFA）处理SK-Hep1和HepaRG细胞，成功模拟高脂环境诱导的细胞脂肪变性。

该试剂（KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。其中，棕榈酸钠可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸钠可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸钠和油酸钠可以单独使用，也可以联合使用。需要说明的是，由于部分肝细胞较为敏感，某些情况下研究人员单独使用棕榈酸（钠）或油酸（钠）进行诱导也能获得理想的实验结果，但在研究代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）时，多数文献更推荐棕榈酸钠与油酸钠联合诱导的技术方案。

3. 细胞处理

在体外模拟高脂环境诱导的肝细胞脂肪变性模型中，本研究采用了油酸（钠）与棕榈酸（钠）以2:1摩尔比混合构成的游离脂肪酸（FFA）复合物，分别处理人肝窦内皮细胞模型SK-Hep1和人肝癌细胞系HepaRG，以此模拟MASLD病理状态下的细胞代谢紊乱。

为了构建HepaRG细胞高脂模型，首先使用Williams’MediumE完全培养基将HepaRG接种于细胞于六孔板中，待细胞生长至80%汇合度时将油酸（钠）和棕榈酸（钠）比例为2:1混合成游离脂肪酸（free fatty acid，FFA），每个孔立刻加入终浓度1mM FFA，诱导培养36h，设置单纯Williams’MediumE完全培养基培养的HepaRG细胞作为对照组，后续用于细胞油红O染色，并收集细胞裂解液，提取相应细胞蛋白，WB检测相关指标等实验。

为了观察FFA处理SK-Hep1细胞后相关蛋白表达变化，首先使用DMEM完全培养基将SK-Hep1接种于细胞于六孔板中，待细胞生长至80%汇合度时将油酸和棕榈酸比例为2:1混合成FFA，每个孔立刻加入终浓度1mM FFA，诱导培养24h，设置单纯DMEM完全培养基培养的SK-Hep1细胞作为对照组，收集细胞，用于后续免疫荧光，提取相应细胞蛋白用于WB检测等实验。

4. 实验数据与分析

首先，研究通过蛋白质免疫印迹实验明确证实，使用1mM FFA处理SK-Hep1细胞12小时后，细胞内的UGCG蛋白表达水平相较于对照组出现显著上调（Figure1）。这一关键发现直接将饮食中的脂质过载与UGCG这一GSL合成关键酶的调控联系起来，表明高脂环境本身是驱动LSECs中UGCG表达升高的重要上游因素，为理解体内模型中观察到的现象提供了体外机制验证。

图1  UGCG在MASLD模型中表达上

进一步，为了探究UGCG活性被抑制后的代谢后果，研究使用20μM的UGCG特异性抑制剂Genz-123346处理SK-Hep1细胞。通过代谢组学分析发现，抑制剂处理组细胞内的总GM3水平相较于对照组显著降低（Figure 2A）。这一结果在动物模型中也得到了一致性验证，LSEC特异性敲除UGCG的小鼠肝组织同样显示出GM3含量的下降（Figure 2B）。这些数据构成了一个清晰的因果链条：FFA诱导UGCG表达上调，从而催化生成更多的GM3。

为了确认GM3对胰岛素信号通路的核心影响，研究进行了外源性GM3添加实验。用20 μM的GM3分别处理SK-Hep1细胞18小时和24小时，免疫荧光结果显示，IRβ的蛋白表达呈现时间依赖性的显著下调（Figure 3）。该实验有力地证明了，由UGCG催化产生的GM3，是导致胰岛素受体表达减少和功能受损的直接效应分子。

图2   LSECs中Ugcg缺失影响IRβ的表达与GM3合成代谢有关

图3  LSECs 中Ugcg 缺失影响IRβ的表达与GM3 合成代谢有关

综上所述，这一系列的体外实验数据共同描绘出一个清晰的分子路径：FFA（OA:PA = 2:1）→ UGCG表达上调 → GM3合成增加 → IRβ表达下调 → 胰岛素信号通路受损。该路径不仅揭示了饮食脂质如何通过UGCG驱动细胞胰岛素抵抗，也为靶向UGCG/GM3轴以改善肝脏代谢提供了坚实的实验依据和潜在的干预策略。

小编有话说：

在体外细胞模型中，采用油酸（钠）和棕榈酸（钠）以2:1比例混合作为游离脂肪酸处理SK-Hep1和HepaRG细胞，成功模拟高脂环境诱导的细胞脂肪变性。通过油红O染色和Western blot分析，发现FFA处理可显著上调UGCG表达并促进脂质积累，而UGCG抑制剂处理则逆转这一效应。本研究所用高脂细胞添加剂（KC006）的品质量稳定、批间一致性高、可以直接加入到培养基中，无需反复加热助溶，为体外代谢疾病模型的构建提供了可靠保障。未来，随着对MASLD机制研究的深入，高纯度脂质试剂将在基础研究与药物筛选中发挥更大作用，推动代谢性疾病治疗策略的创新与转化。

参考文献

韩蕊. 肝窦内皮细胞中的UGCG在代谢功能障碍相关的脂肪性肝病和胰岛素抵抗中的功能和机制研究[D]，中国人民解放军军事科学院,2025.