Redox Biology(IF/12):棕榈酸(PA)诱导肝细胞(AML12、原代肝细胞)脂肪变性以研究外泌体载药改善脂肪肝炎(NASH)
在细胞实验中,研究人员首先在体外培养巨噬细胞(RAW264.7和BMDMs)及肝细胞(AML12和原代肝细胞),用LPS刺激巨噬细胞并加载不同外泌体处理,收集条件培养基(CM)与肝细胞共培养,评估脂质积累情况;进一步通过siRNA敲低Sod1表达,验证其在脂质代谢中的作用;还采用Oil Red O染色、TG检测、Western blot、qRT-PCR等多种技术手段,全面评估外泌体递药系统对炎症因子表达和脂代谢的影响。
本研究中的棕榈酸(PA)高脂细胞添加剂是连接巨噬细胞炎症反应与肝细胞代谢紊乱的核心桥梁。通过建立稳定的棕榈酸(PA)诱导肝细胞脂肪变性模型,研究有力地证明了靶向巨噬细胞可间接改善肝细胞脂代谢。整个细胞培养体系设计严谨,涵盖了巨噬细胞的处理与肝细胞的脂质诱导,并通过条件培养基共培养、基因敲低、因子添加等多种技术手段,清晰地揭示了“巨噬细胞-炎症因子-肝细胞脂代谢-Sod1”这一作用轴线的详细机制。
Redox Biology(IF/12):棕榈酸(PA)诱导肝细胞(AML12、原代肝细胞)脂肪变性以研究外泌体载药改善脂肪肝炎(NASH)
1. 前言
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)作为全球高发的慢性肝病,核心病理机制涉及肝巨噬细胞过度分泌促炎因子TNF和IL1β,驱动肝细胞脂质沉积、炎症及纤维化。当前临床缺乏靶向治疗药物,而外泌体因其天然肝靶向性(静脉注射后主要富集于肝脏并被肝巨噬细胞摄取)和优异生物相容性,成为递送抗炎药物的理想载体。本研究基于肝巨噬细胞在NASH中的核心作用,提出利用外泌体精准递送抑制剂以调控炎症微环境的新策略。
本研究的技术路线是:通过胆固醇修饰将TNF反义寡核苷酸(ASO-TNF)嵌入外泌体膜,或经电穿孔装载糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2DG),构建功能化外泌体(Exo/ASO-TNF、Exo/2DG),经尾静脉注射治疗饮食诱导(CDAA/MCD)的NASH模型小鼠,评估其对肝炎症及脂代谢的改善作用。
在细胞实验中,研究人员首先在体外培养巨噬细胞(RAW264.7和BMDMs)及肝细胞(AML12和原代肝细胞),用LPS刺激巨噬细胞并加载不同外泌体处理,收集条件培养基(CM)与肝细胞共培养,评估脂质积累情况;进一步通过siRNA敲低Sod1表达,验证其在脂质代谢中的作用;还采用Oil Red O染色、TG检测、Western blot、qRT-PCR等多种技术手段,全面评估外泌体递药系统对炎症因子表达和脂代谢的影响。
2. 高脂细胞添加剂
文中采用棕榈酸作为高脂细胞添加剂(现货号KC003,Kunchuang Science and Technology Development)诱导肝细胞(AML12、原代肝细胞)脂肪变性以构建非酒精性脂肪肝病(NAFLD)细胞模型。
该试剂(KC003)包括了独立包装的6mmol/L棕榈酸和溶剂对照,试剂为无菌液体,能够直接使用,具备溶剂无毒、常温无析出,无需加热助溶等优点,显著减少操作步骤,提升实验的稳定性。其中,棕榈酸钠可以用来诱导多种细胞的损伤和炎症。
由于某些肝细胞系较为敏感,单独使用棕榈酸也可能获得理想的实验结果,但是绝大数论文在研究非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)时,更推荐采用250μM的PA棕榈酸(钠)与500μM的油酸(钠)联合诱导的技术方案,不仅能更好地模拟人体内的病理生理环境,还能提高实验结果的可靠性和科学性。
3.细胞处理及部分实验结果
1)体外验证2DG及ASO-TNF对巨噬细胞炎症因子的抑制作用
巨噬细胞炎症调控实验中,2DG(2mM)处理显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞和原代骨髓巨噬细胞(BMDMs)中TNF和IL1β的mRNA与蛋白表达(图1D-F:Western blot条带显示TNF/IL1β蛋白灰度值下降>50%,qPCR显示mRNA降低60-80%)。ASO-TNF转染则特异性沉默TNF表达(图1E-F),证实二者靶向有效性。外泌体装载实验中,透射电镜(图2C)显示bEnd.3细胞来源外泌体呈典型杯状囊泡(直径30-150nm),粒径检测(图2B,NTA)证实装载后尺寸稳定(约110nm);Western blot(图2D)验证外泌体标志蛋白Alix/Tsg101/Flotillin1高表达,且无线粒体污染(Vdac1阴性)。胆固醇修饰的ASO-TNF通过疏水作用高效嵌入外泌体膜,qPCR检测显示miR-188装载量提升100倍(图2F);电穿孔装载2DG的浓度达400 nmol/μg(图2G)。
图1 2-脱氧-D-葡萄糖或反义寡核苷酸抑制巨噬细胞炎性因子和/或IL-1β的表达
图2ASO-肿瘤坏死因子或2DG可装载外泌体
2)表征外泌体装载效率及巨噬细胞靶向递送能力
功能化外泌体的细胞递送方面,DiI荧光标记显示静脉注射后6小时,外泌体主要富集于肝脏,并与肝组织F4/80+巨噬细胞共定位。体外共培养实验证实,Exo/ASO-TNF可降低LPS刺激的BMDMs中TNF mRNA 75%,Exo/2DG同步抑制TNF和IL1β表达(Western blot显示蛋白水平降低>60%)。体内实验中,MCD饮食小鼠经Exo/ASO-TNF或Exo/2DG治疗2周后,分选的F4/80+肝巨噬细胞中TNF/IL1β mRNA显著下调(降幅50-70%)。
3)基于条件培养基(CM)模型,验证巨噬细胞来源炎症因子对肝细胞脂质沉积的影响及外泌体干预效果(图3)
如图3所示,研究人员构建了棕榈酸(PA)诱导的肝细胞脂质积累模型以模拟NASH的核心病理特征。具体而言,将巨噬细胞(RAW264.7或BMDMs)与装载药物(Exo/ASO-TNF或Exo/2DG)的外泌体共育后,收集其条件培养基(CM),再将此CM与AML12肝细胞或原代肝细胞在含200μM棕榈酸的培养基中共同培养48小时(图3A)。通过油红O染色和甘油三酯(TG)含量检测评估肝细胞内脂滴形成情况。结果显示,与对照组CM相比,经Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理后的巨噬细胞CM,其诱导肝细胞脂质积累的能力显著减弱(图3B-D)。此外,研究还通过在PA培养基中额外添加外源TNF/IL1β进行反向验证,证实这两种炎症因子是介导脂质积累的关键因素。为进一步阐明机制,研究在AML12肝细胞中利用siRNA敲低Sod1表达,发现此举几乎完全逆转了Exo/ASO-TNF或Exo/2DG-CM所带来的抗脂质积累益处,确证了Sod1在该通路中的核心地位。
图3 Exo/ASO-TNF或Exo/2DG可减轻体外培养的原代肝细胞的脂质蓄积
4.总结
炎症介质TNF和IL1β主要来源于肝脏的巨噬细胞,在NASH的进展中起着至关重要的作用。同时,静脉注射的外泌体主要分布在肝脏,主要被肝巨噬细胞摄取。在此,我们旨在评估通过外泌体靶向抑制TNF和IL1β在肝巨噬细胞中表达作为治疗NASH的潜在策略的可行性。在这项研究中,我们证明了针对TNF的反义寡核苷酸或2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)有效地抑制了巨噬细胞中TNF和/或IL1β的表达。体外和体内实验表明,负载ASO-TNF或2DG的外泌体能抑制巨噬细胞表达TNF和/或IL1β。此外,输注Exo/ASO-TNF或Exo/2DG显著减轻胆碱缺乏氨基酸定义(CDAA)或蛋氨酸和胆碱缺乏饮食喂养的小鼠的实验性脂肪性肝炎。RNA-Seq结果显示,Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理可显著抑制促炎信号通路。从机制上,我们观察到给予Exo/ASO-TNF或Exo/2DG可以通过上调超SOD1的表达来延缓NASH进展。综上,本研究结果表明,输注负载ASO-TNF或2DG的外泌体可以减轻实验性脂肪性肝炎的发生。因此,输注载有抗炎药的外泌体有望成为NASH的一种潜在的治疗策略。
小编有话说:
本研究中的棕榈酸(PA)高脂细胞添加剂是连接巨噬细胞炎症反应与肝细胞代谢紊乱的核心桥梁。通过建立稳定的棕榈酸(PA)诱导肝细胞脂肪变性模型,研究有力地证明了靶向巨噬细胞可间接改善肝细胞脂代谢。整个细胞培养体系设计严谨,涵盖了巨噬细胞的处理与肝细胞的脂质诱导,并通过条件培养基共培养、基因敲低、因子添加等多种技术手段,清晰地揭示了“巨噬细胞-炎症因子-肝细胞脂代谢-Sod1”这一作用轴线的详细机制。
作为高品质棕榈酸(PA)高脂细胞添加剂的供应商,我们深知在NASH等代谢性疾病研究中,构建可靠、稳定的体外细胞模型至关重要。本研究中采用的200μM棕榈酸诱导方案,再次验证了产品在模拟肝细胞脂肪变性方面的有效性和一致性。我们提供的高纯度棕榈酸,以其优异的溶解性和批次稳定性,可为您的研究提供坚实保障,助您精准探索脂毒性、胰岛素抵抗、炎症反应等关键生物学过程,共同推动肝脏代谢健康领域的创新药物发现与机制研究。
参考文献
He Fei, et al."Exosome-equipped TNF antisense oligodeoxynucleotide or 2-deoxy-D-glucose ameliorated nonalcoholic steatohepatitis by modulating superoxide dismutase 1 in mice". Redox Biol. 2025 Mar:80:103488.