细胞外囊泡顶刊JEV（IF/14.5）：棕榈酸钠诱导分离骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）构建NAFLD细胞模型

细胞外囊泡顶刊JEV（IF/14.5）：棕榈酸钠诱导分离骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）构建NAFLD细胞模型

Journal of Extracellular Vesicles

1. 前言

2型糖尿病（T2DM）与非酒精性脂肪肝病（NAFLD）共存时，代谢紊乱与神经血管并发症相互恶化，缺乏跨器官干预策略。本研究聚焦2型糖尿病（T2DM）合并非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的跨器官治疗困境。技术背景强调：NAFLD在T2DM患者中发病率高达50%，加剧代谢紊乱及神经血管并发症（如血脑屏障破坏、认知衰退）；肝源性因子（如PDGFB）通过循环系统影响脑内周细胞功能，而间充质基质细胞（MSC）来源的细胞外囊泡（EVs）具有天然器官靶向性和免疫调节潜能，但其在多器官互作中的机制尚未明晰。本文创新性提出"肝-脑轴"靶向策略，通过EVs调控肝巨噬细胞PDGFB信号，改善脑内周细胞-TTR-GDF11通路，为协同治疗提供新思路。

技术路线为：从人脐带分离MSCs并提取EVs，经SPECT/CT验证其肝脏靶向性后，注射至db/db（T2DM-NAFLD）和MCD饮食（NASH）小鼠模型；通过snRNA-seq分析海马细胞图谱，结合AAV介导的肝PDGFB调控，阐明EVs经miR-31-5p抑制PDGFB-PDGFRβ轴，进而调节TTR神经保护功能及GDF11介导突触可塑性的机制。

其中细胞实验内容涵盖：分离骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）和RAW264.7细胞，以棕榈酸钠（PA）诱导脂肪变性及炎症（模拟NAFLD）；用MSC-EVs或miR-31-5p修饰的HEK293-EVs处理细胞，通过流式检测M1/M2极化（CD86/CD206）、ELISA分析炎性因子（TNF-α/IL-10）、Western blot评估PDGFB下游p-AKT/p-p65通路；原代海马神经元接受GDF11重组蛋白±Smad抑制剂干预，验证突触修复机制。

2. 高脂细胞添加剂

文中采用棕榈酸钠作为高脂细胞添加剂（现货号KC006，Kunchuang Biotechnology）分离骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）构建非酒精性脂肪肝病（NAFLD）细胞模型。

该试剂（KC006）包括了独立包装的6mmol/L棕榈酸钠和12mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。其中，棕榈酸钠用来诱导细胞损伤和炎症，油酸钠用来诱导细胞代谢异常。

棕榈酸钠和油酸钠可以单独使用，也可以联合使用。由于某些细胞系较为敏感，单独使用棕榈酸钠或油酸钠也可能获得理想的实验结果，但是绝大数论文在研究非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）时，更推荐采用棕榈酸（钠）与油酸（钠）联合诱导的技术方案，不仅能更好地模拟人体内的病理生理环境，还能提高实验结果的可靠性和科学性。

3.细胞处理及部分实验结果

细胞实验以原代培养为核心，包括建立巨噬细胞模型、EVs干预机制研究和神经细胞验证等部分。其中，骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）经棕榈酸（PA）刺激模拟NAFLD炎症环境，附图病理染色显示脂滴堆积。MSC-EVs预处理后，ELISA检测炎症因子（TNF-α、IL-1β）显著降低，Western blot证实PDGFB信号抑制。海马神经元与脑微血管周细胞共培养显示，EVs通过PDGFB-PDGFRβ轴增强周细胞存活，并激活GDF11-Smad通路促进突触可塑性。

具体如图1所示，研究通过棕榈酸钠（PA）诱导BMDMs构建NAFLD细胞模型，PA刺激显著提升脂质积累（Oil Red O染色阳性率增加）和炎症因子分泌（TNF-α、IL-1β升高），模拟肝巨噬细胞的M1极化状态（图1D-F）。当用MSC-EVs预处理后，PA诱导的脂滴沉积减少（图1G），同时炎性因子TNF-α、IL-1β显著下调，抗炎因子IL-10、TGF-β上调（图1D-F），流式细胞术证实CD86+（M1）细胞减少而CD206+（M2）细胞增多（图S7A-P），表明EVs驱动巨噬细胞向修复表型转化。

为解析EVs的活性成分，研究筛选出富集于EVs的miR-31-5p（图1A），并通过基因修饰实验验证其功能：将miR-31-5p模拟物（mimic）载入HEK293细胞来源EVs（HEK-EVmimic），处理PA刺激的BMDMs后，PDGFB表达降低50%（图1C），且下游促纤维化信号p-AKT/AKT和p-p65/p65磷酸化水平显著抑制（图1H-J）；而miR-31-5p抑制剂（inhibitor）则逆转该保护作用（图1C,G）。此结果在动物模型中进一步验证：注射miR-31-5p激动剂（agomir）的MCD小鼠肝脏PDGFB、α-SMA（星状细胞活化标志）及CD68（巨噬细胞浸润）表达下降（图1L-O），且肝组织p-AKT/p-p65降低（图1S-U）。

海马神经元实验揭示跨器官机制：EVs通过抑制肝PDGFB，间接激活脑内GDF11-TGFβR信号（图2F）。原代海马神经元经GDF11重组蛋白干预后，Smad2磷酸化（pSMAD2）水平升高（图S6F-H），而加入Smad2/3抑制剂ACE-536后该效应被阻断，证实GDF11通过Smad通路调节突触可塑性。与此一致，EV治疗组db/db小鼠海马GDF11蛋白表达增加（图2G-I），伴随突触标志物Synapsin I（SYN1）上调（图2T-U）及mEPSC频率增高（图2Q-S），电镜显示神经元树突复杂性恢复（图2K-P）。

图1 EVs的NGS分析和miR-31-5p在重度NAFLD中的调节作用

图2 EV处理的db/db海马中的周细胞恢复和GDF11活化

4.总结

2型糖尿病（T2DM）合并非酒精性脂肪肝（NAFLD）加重了代谢紊乱和神经血管并发症，给治疗带来了重大挑战。我们使用SPECT/CT成像证实，间充质基质细胞（MSCs）得细胞外小泡（EV）主要在肝脏中积累，在肝脏中它们递送miR-31-5p来抑制肝脏巨噬细胞产生得血小板衍生生长因子B（PDGFB）。这种干预可阻止NAFLD进展，并在肝脏修复和神经血管改善之间建立机制联系。具体而言，MSC-EVs通过抑制PDGFB-PDGFRβ轴促进海马周细胞恢复，并协调生长分化因子11（GDF11）的激活，从而促进神经可塑性。此外，AAV注射表明肝脏PDGFB调节重新校准甲状腺素运载蛋白（TTR）动力学，从而恢复其神经保护功能并防止其在脑中的病理性沉积。这些发现将MSC-EV定位为一种变革性的治疗平台，利用肝-脑轴来解决T2DM的相互交织的代谢和神经血管并发症，为临床转化提供了一种有前景的途径。

小编有话说：

棕榈酸钠（PA）作为高脂刺激剂，是诱导细胞脂肪变性和炎症的核心工具。PA（Kunchuang Biotechnology , KC006）用于激活BMDMs和RAW264.7细胞的NF-κB/PI3K-AKT通路，模拟NAFLD的脂毒性及纤维化微环境。细胞经PA（150μM）处理24小时后，脂质沉积（Oil Red O染色）和炎性因子（ELISA）显著升高，而EVs或miR-31-5p干预有效逆转该表型。试剂使用严格遵循浓度梯度（PDGFB重组蛋白：10-100ng/mL；LPS：100ng/mL），并通过凋亡检测（Annexin V/PI）、Western blot等验证模型可靠性。

高纯度的棕榈酸钠（KC006）具有批次稳定性和低内毒素等特性，能够为本研究NAFLD细胞模型的构建奠定基础。未来研究可进一步探索其与油酸钠的协同效应，优化脂毒性损伤模型，推动代谢性疾病药物筛选。该试剂为靶向PDGFB信号或巨噬细胞极化的疗法提供标准化工具，助力肝-脑轴机制研究与转化应用。

参考文献

Minghao Du, Hao Yang, Jinyun Niu, et al. 2025."Umbilical Cord-Mesenchymal Stromal Cell-Derived Extracellular Vesicles Target the Liver to Improve Neurovascular Health in Type 2 Diabetes With Non-Alcoholic Fatty Liver Disease". J Extracell Vesicles. 2025 Jul;14(7):e70125. doi: 10.1002/jev2.70125.