WJG（IF 7.7）：高脂细胞添加剂模拟体外高脂微环境构建HepG2细胞高脂模型

1. 研究背景

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种与肥胖、2型糖尿病及高脂血症密切相关的慢性代谢性肝脏疾病，其核心病理表现包括肝脏脂质异常蓄积、糖脂代谢紊乱、肝细胞损伤以及炎症反应。随着MASLD患病负担持续增加，寻找能够改善肝脏脂质代谢并具有明确作用机制的干预策略成为研究重点。过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）是肝脏中重要的脂质代谢调控核受体，参与脂肪酸氧化、酮体生成以及炎症调节。论文指出，MASLD患者肝脏PPARα表达降低，并且PPARα与脂肪酸β-氧化密切相关，因此PPARα可能是干预肝脏脂质蓄积的重要作用靶点。Lianhe Xiaozhi ointment（LXO）来源于经典黄连温胆汤，既往临床应用提示其能够改善MASLD患者的肝功能及糖脂代谢，但其活性成分和具体分子机制此前并不明确。

2. 技术路线

本文采用“成分鉴定—靶点预测—动物验证—转录组分析—细胞验证—机制确认”的技术路线。首先利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）分析LXO中的化学成分，并结合网络药理学筛选潜在活性成分、疾病相关靶点及信号通路；随后建立高脂饮食诱导的MASLD小鼠模型，从整体动物水平评价LXO对体重、糖脂代谢、肝功能、肝脏脂质蓄积及炎症的影响。在此基础上，通过肝脏转录组测序和qRT-PCR、Western blot等实验进一步锁定PPARα信号通路，再以油酸（OA）/棕榈酸（PA）诱导的HepG2高脂细胞模型进行体外验证，并加入PPARα抑制剂GW6471进行机制干预，从而判断LXO降低细胞脂质蓄积的作用是否依赖PPARα。其中，细胞实验逻辑可以概括为“正常HepG2细胞培养→OA+PA高脂刺激→加入LXO来源含药血清干预→检测脂质代谢及PPARα通路变化”。

3. HepG2高脂细胞模型

在细胞实验部分，研究选用HepG2人肝癌细胞作为体外肝细胞模型，采用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养。为了模拟高脂环境，研究人员采用游离脂肪酸（FFA）组合进行建模，其中油酸（OA）与棕榈酸（PA）的比例设为2∶1。依据相关文献、试剂生产商说明及前期实验结果，最终确定油酸（OA）浓度为200 μM、棕榈酸（PA）浓度为100 μM，并在加入FFA及LXO来源含药血清后培养约48 h。研究进一步设置LXO来源含药血清干预以及PPARα抑制剂GW6471组，通过细胞活力、细胞内TG、Oil Red O染色、PPARα及其下游蛋白表达和细胞外β-羟基丁酸（BHB）等指标评价LXO对高脂HepG2细胞的影响。

从细胞模型的建立来看，本文并不是简单使用单一脂肪酸处理HepG2，而是采用OA和PA联合刺激形成高脂细胞环境，这一条件使体系具有明确的脂肪酸负荷，同时能够用于观察肝细胞脂质蓄积以及后续脂质代谢通路变化。其中，棕榈酸常用来诱导细胞损伤和炎症，油酸常用来诱导细胞代谢异常，两者联合更接近体内混合脂肪酸暴露状态，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂质积累、细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

高脂细胞添加剂（货号KC006）包含独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠、12 mmol/L油酸钠及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的棕榈酸相比，具有溶剂无毒、常温无析出、冻融无析出、无需加热助溶、浓度准确、能够呈现清晰的剂量依赖性趋势等显著优势。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例添加至完全培养基（含10% FBS，1% P/S）中即可，无需额外操作，处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24-72小时为宜。

4. 部分实验内容和结果

首先，原文从整体研究设计层面展示了LXO治疗高脂饮食诱导MASLD的研究框架。该研究将化学成分分析、网络药理学、动物实验、肝脏转录组以及HepG2体外高脂模型结合起来。细胞实验处在机制验证的重要位置：动物实验发现LXO能够改善肝脏脂质代谢，而转录组分析进一步提示PPAR信号通路明显富集，因此研究人员随后利用HepG2高脂模型验证PPARα是否直接参与LXO的降脂作用。

在进入细胞实验之前，论文已经通过动物实验观察到LXO具有改善高脂代谢表型的作用。其中，高脂饮食小鼠出现体重、空腹血糖、ALT、AST、TG及其他代谢指标升高，同时肝脏出现明显脂质蓄积；LXO处理后，动物体重增长受到抑制，葡萄糖耐量改善，TG、NEFA以及肝脏脂质蓄积下降，肝脏IL-1β和IL-18水平也受到抑制。由此，细胞实验并不是独立开展，而是承担了进一步回答“LXO为什么能够降低肝脏脂质”的机制验证任务。

肝脏转录组进一步发现，PPAR信号通路在不同实验组之间明显富集，LXO能够提高PPARα及相关脂质分解代谢基因的表达，其中包括Cpt1a、Acox1和Hmgcs2。进一步的蛋白水平分析也显示，LXO能够提高PPARα、CPT1A、ACOX1和HMGCS2等蛋白，并伴随β-羟基丁酸生成增加。也就是说，前期动物实验和转录组结果共同提出了一个较为清晰的机制假设：LXO可能通过增强PPARα信号，促进脂肪酸β-氧化及酮体生成，从而减少肝细胞内脂质蓄积。

图1成为本文细胞实验的核心，图1A首先评价不同处理条件下HepG2细胞的活力。研究发现，PA参与的高脂处理能够降低HepG2细胞活力，而LXO来源含药血清能够改善这一变化；图1同时设置了PPARα抑制剂GW6471，其使用浓度为10 μM。由此，细胞活力实验不仅用于观察高脂肪酸刺激本身对细胞状态的影响，也用于确认后续脂质代谢检测所处的细胞状态。论文结果显示，GW6471并未明显改变LXO来源含药血清对细胞活力的这一影响，因此后续LXO的降脂效应并不能简单解释为细胞存活率变化所造成的假象。

图1. LXO在HepG2细胞中依赖PPARα的机制

从干预设置来看，图1进一步比较了OA+PA高脂模型与LXO来源含药血清干预后的细胞状态。图中涉及5.0%和10.0%的LXO来源含药血清处理条件，同时设置高脂模型组，并结合GW6471进行PPARα通路阻断。图1B进一步从生化指标层面检测细胞内甘油三酯（TG）。高脂OA+PA处理形成细胞脂质蓄积后，LXO来源含药血清能够降低HepG2细胞内TG水平；研究同时采用100 μM非诺贝特作为具有降脂作用的PPARα激动剂进行比较。结果显示，LXO与非诺贝特均能够降低细胞内TG，而加入GW6471后，LXO的降TG作用受到部分抵消。这一结果对于机制验证非常关键，因为它将“细胞脂质下降”与“PPARα被抑制后效应减弱”联系起来，为LXO通过PPARα参与细胞降脂提供了药理学证据。

如图1C所示，研究进一步采用Oil Red O染色观察细胞内脂滴。Oil Red O能够对细胞中的中性脂质进行可视化，因此与图1B的TG定量结果形成相互验证。图中设置50 μm比例尺，可以直接观察不同处理条件下HepG2细胞脂滴的变化。论文指出，Oil Red O染色结果进一步验证了LXO降低细胞脂质蓄积的作用。因此，在实验评价体系中，细胞内TG属于定量指标，而Oil Red O染色属于形态学和脂滴水平的直观验证，两者共同提高了细胞高脂模型评价的完整性。

在分子机制层面，图1D检测了PPARα及其下游脂肪酸氧化相关蛋白，包括CPT1A、ACOX1和HMGCS2。结果显示，LXO能够提高这些蛋白的表达，而加入GW6471后，这种促进作用受到抵消。CPT1A参与脂肪酸进入线粒体后的氧化过程，ACOX1与过氧化物酶体脂肪酸氧化有关，HMGCS2则与肝脏酮体生成密切相关。因此，图1D实际上将“PPARα激活”进一步连接到“脂肪酸氧化和酮体生成”这一代谢过程，使前面转录组及动物实验中观察到的PPARα相关变化在体外细胞层面得到进一步支持。

图1E则检测细胞外β-羟基丁酸（BHB）。由于HMGCS2参与酮体生成，因此BHB可以作为脂肪酸氧化和酮体生成增强的功能性指标之一。研究发现，LXO提高PPARα、CPT1A、ACOX1和HMGCS2蛋白表达的同时，也提高细胞外BHB水平，而GW6471能够对这些变化产生抵消作用。由此，本文细胞实验形成了相对完整的证据链：OA 200 μM与PA 100 μM联合建立高脂HepG2细胞模型，LXO来源含药血清进行干预后，细胞内TG及脂滴蓄积降低，同时PPARα及其脂肪酸氧化相关蛋白表达增强，BHB生成增加；当PPARα受到GW6471抑制后，LXO的部分降脂及代谢促进作用随之减弱。

从实验操作逻辑而言，本研究通过固定比例的OA/PA联合刺激模拟高脂环境，再利用LXO来源含药血清进行干预，并以PPARα抑制剂作为机制阻断工具。OA与PA的比例为2∶1，终浓度分别为200 μM和100 μM，FFA及LXO来源含药血清加入后培养约48 h；GW6471浓度为10 μM。之后分别开展细胞活力、TG定量、Oil Red O染色、Western blot及BHB检测。其实验安排使“建模—干预—表型检测—通路检测—抑制验证”形成连续链条，也与动物实验及转录组所得到的PPARα结果相互呼应。

进一步结合图2可以看到，论文最终提出的机制模型是将脂肪酸代谢、肝脏脂质蓄积、炎症以及肠道菌群变化联系起来。LXO激活PPARα后，可促进CPT1A、ACOX1和HMGCS2相关脂质分解及酮体生成，同时与NEFA、TG等代谢指标变化相联系；另一方面，PPARα与NF-κB炎症通路之间也存在调节关系。图2因此对前面的动物实验、细胞实验以及肠道菌群分析进行了综合归纳。

图2  连和消脂膏治疗代谢功能障碍相关脂肪性肝病的拟议机制

5. 总结

本文的OA/PA高脂细胞实验以HepG2为基础，通过OA 200 μM和PA 100 μM、2∶1比例联合刺激，建立脂质蓄积型高脂细胞环境，FFA与LXO来源含药血清处理时间约为48 h。在此基础上，研究采用5%和10%LXO来源含药血清进行干预，并设置10 μM GW6471进行PPARα药理学阻断，同时以100 μM非诺贝特作为PPARα激动剂相关对照。细胞活力、TG、Oil Red O、PPARα/CPT1A/ACOX1/HMGCS2蛋白以及BHB共同构成评价体系。结果表明，LXO能够减轻OA/PA诱导的HepG2脂质蓄积，并增强PPARα相关脂肪酸氧化和酮体生成过程；GW6471对相关效应的抵消进一步支持PPARα在其中发挥重要作用。

从高脂细胞添加剂的实验应用角度看，本文采用的棕榈酸（PA）和油酸（OA）均由鲲创生物（Kunchuang Biotechnology）提供，该类OA/PA脂肪酸组合可用于构建HepG2细胞脂质代谢研究所需的体外高脂模型；结合本文所采用的200 μM OA、100 μM PA及约48 h处理条件，可为相关脂质蓄积、脂肪酸氧化及代谢通路研究提供实验参考。对于后续研究，可在严格遵循具体产品说明书和预实验验证的基础上，对不同脂肪酸组合、浓度和处理时间开展进一步优化，从而提高模型稳定性和实验重复性。

参考文献

Nie LJ, Wang GX, Yang XY, Sun J, Cao YT, Lou Y, Lu YF, Yu JY, Zhou XQ. Lianhe Xiaozhi ointment ameliorates metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease via peroxisome proliferator-activated receptor alpha pathway activation. World J Gastroenterol 2026; 32(9): 114544. DOI: 10.3748/wjg.v32.i9.114544. URL: https://www.wjgnet.com/1007-9327/full/v32/i9/114544.htm