HepG2细胞胰岛素抵抗模型的诱导条件筛选及棕榈酸钠诱导方案评价 《Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity》

1. 研究背景

胰岛素抵抗（IR）是机体对胰岛素敏感性下降、摄取和利用葡萄糖能力降低的状态，是肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪性肝病等疾病的共同病理基础，且常先于这些疾病出现。因此，改善胰岛素抵抗是相关疾病治疗和药物研发的重要策略，而稳定可靠的体外细胞模型是研究成功的前提。HepG2细胞来源于人肝母细胞瘤，具有与肝细胞相似的代谢功能，可模拟人肝胰岛素抵抗状态，是体外研究胰岛素抵抗发病机制、降糖药物筛选及作用机制的常用细胞。然而文献中IR-HepG2模型建立方法并不统一，常见有葡萄糖胺诱导、高糖联合高胰岛素诱导和棕榈酸钠诱导，且同一方法的浓度和作用时间也不一致，不同诱导方法形成的模型是否存在差异尚不清楚。基于此，本文用三种方法诱导HepG2胰岛素抵抗并简要评价，以期提供简单、稳定、可重复的细胞模型。

2. 技术路线与实验思路

本文的技术路线是先以HepG2细胞为对象，分别设置葡萄糖胺、高糖联合高胰岛素、棕榈酸钠三种诱导方案；通过CCK-8检测细胞活力确定安全浓度与时间，通过葡萄糖检测试剂盒评价葡萄糖消耗，通过2-NBDG结合共聚焦显微镜和流式细胞术评价葡萄糖摄取，通过Western blot检测胰岛素刺激前后p-AKT/AKT水平，通过RT-qPCR检测G6Pase、PC、PCK1等糖异生相关酶mRNA，通过PAS染色观察糖原含量，并利用RNA-seq比较三种模型转录组差异及KEGG/GO富集通路。最终综合表型、信号通路和转录组结果，筛选更简单稳定的诱导方法。

图1 技术路线

3. 人肝癌细胞系HepG2胰岛素抵抗模型（IR-HepG2）

细胞实验以HepG2细胞为材料，用HepG2专用培养基在37℃、5% CO2条件下培养，每2-3天换液，按生长状态传代；PBS洗两次，0.25%胰酶消化3 min，培养基终止消化，900 rpm离心4 min，重悬并调整密度后接种。模型建立时48孔板每孔接种8×10³个细胞，分别给予葡萄糖胺9、18、36 mM作用12-48 h，高糖（4.5 g/L）联合胰岛素0.1、1、10 μM作用12-72 h，棕榈酸钠0.15、0.2、0.25 mM作用12、24、48 h；综合细胞活力和葡萄糖消耗确定18 mM葡萄糖胺18 h、4.5 g/L高糖联合1 μM胰岛素作用24 h、0.2 mM棕榈酸钠24 h为诱导条件，并检测形态、糖摄取、p-AKT/AKT、糖异生酶mRNA、糖原及转录组。

其中，棕榈酸钠高脂细胞添加剂（原货号SYSJ-KJ002，现货号KC002）包含独立包装的10mM浓度的棕榈酸钠、及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的棕榈酸相比，具有溶剂无毒、常温无析出、冻融无析出、无需加热助溶、浓度准确、能够呈现清晰的剂量依赖性趋势等显著优势。

图2 高脂细胞添加剂型号

实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例添加至完全培养基（含10% FBS，1% P/S）中即可，无需额外操作，处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24-72小时为宜。需要说明的是，棕榈酸钠可以用来诱导多数常见细胞的脂毒性损伤和炎症，包括诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等，可配合高糖处理模拟2型糖尿病高糖高脂损伤模型、也可配合油酸钠诱导细胞脂质堆积。

4. 部分实验内容和注意细节

在细胞处理与模型条件筛选方面，本文先以CCK-8确定三种诱导条件对HepG2细胞活力的影响。如图3A-C所示，图中展示了不同浓度葡萄糖胺、胰岛素和棕榈酸在不同时间点的细胞活力变化：较高浓度葡萄糖胺长时间作用可降低细胞活力，高糖联合高胰岛素对活力影响较小，棕榈酸钠在0.2 mM及以下时对活力影响不显著，而0.25 mM作用48 h后活力下降。进一步结合葡萄糖消耗结果（如图3D-F所示，图中展示了三种诱导条件不同时间点的葡萄糖消耗变化），最终选择18 mM葡萄糖胺18 h、1 μM胰岛素联合高糖24 h、0.2 mM棕榈酸钠24 h作为后续诱导条件；如图3G-J所示，图中展示了对照组及三种诱导后HepG2细胞的形态，诱导后细胞形态未见明显改变。该部分说明模型诱导需要在“有效”和“细胞毒性可接受”之间取得平衡。

本文所用高脂细胞添加剂为棕榈酸钠（sodium palmitate，文中简称SP）。具体操作是将棕榈酸钠溶于含1 g/L葡萄糖的HepG2专用培养基中，设置0.15、0.2、0.25 mM三个浓度，分别作用12、24、48 h；先以CCK-8排除明显细胞毒性，再以葡萄糖消耗筛选有效时间。如图3F所示，图中展示了0.2 mM棕榈酸钠作用不同时间后葡萄糖消耗下降，结合细胞活力结果选择0.2 mM作用24 h；如图3J所示，图中展示了0.2 mM棕榈酸钠作用24 h后细胞形态与对照组相比无明显异常。该浓度和时间既能使HepG2细胞出现胰岛素抵抗表型，又避免过高浓度长时间处理造成的非特异性毒性，因此后续以0.2 mM SP处理24 h作为高脂诱导方案。

图3 IR-HepG2细胞诱导条件的确定

图4 不同诱导条件对细胞糖吸收能力的影响

在葡萄糖摄取评价中，本文用2-NBDG标记活细胞摄取能力，并结合共聚焦显微镜和流式细胞术。如图4所示，图中展示了三种诱导条件对HepG2细胞2-NBDG摄取的影响：葡萄糖胺组共聚焦荧光下降但流式差异不显著；高糖联合高胰岛素组细胞摄取增强；0.2 mM棕榈酸钠作用24 h后，共聚焦和流式结果均显示细胞2-NBDG摄取能力下降（如图4I-L所示，图中展示了棕榈酸钠组荧光强度和流式峰形较对照组降低）。这说明棕榈酸钠诱导的HepG2细胞在糖摄取环节表现出较稳定的胰岛素抵抗特征，而高糖联合高胰岛素组在本实验条件下表现为摄取增强，未出现稳定的摄取下降表型。

在胰岛素信号通路评价中，本文检测胰岛素刺激前后p-AKT/AKT水平。如图5所示，图中展示了三种诱导方法对p-AKT、AKT蛋白表达及p-AKT/AKT比值的影响：正常对照组在100 nM胰岛素刺激后p-AKT/AKT明显升高，说明胰岛素信号可被激活；葡萄糖胺组和高糖联合高胰岛素组在胰岛素刺激后p-AKT/AKT仍升高；而棕榈酸钠组在胰岛素刺激后p-AKT/AKT无显著变化，提示细胞对胰岛素的敏感性下降。该结果与棕榈酸钠诱导的糖摄取下降相呼应，说明0.2 mM SP作用24 h可削弱HepG2细胞的胰岛素信号应答。

图5 三种诱导方法对p-AKT/AKT水平的影响

图6 三种诱导方法对细胞糖异生相关酶基因表达水平的影响

在糖异生相关酶和糖原评价中，本文用RT-qPCR检测G6Pase、PC、PCK1 mRNA，并用PAS染色观察糖原含量。如图6所示，图中展示了三种诱导方法对糖异生相关酶mRNA的影响：葡萄糖胺和棕榈酸钠刺激后G6Pase、PC、PCK1表达升高，高糖联合高胰岛素刺激后仅PCK1升高；如图6D-G所示，图中展示了PAS染色结果，葡萄糖胺和棕榈酸钠处理后糖原含量下降，而高糖联合高胰岛素组糖原含量无明显变化。该部分从糖异生增强和糖原合成减少两个角度进一步支持棕榈酸钠诱导模型的可靠性。

在转录组层面，本文用RNA-seq比较三种诱导方法的差异。文中结果展示了三种诱导后IR-HepG2细胞的差异基因热图、胰岛素信号通路相关基因火山图、差异基因韦恩图和KEGG富集气泡图：葡萄糖胺和棕榈酸钠诱导的细胞转录组一致性较好，而高糖联合高胰岛素组一致性较差；三种方法在胰岛素信号通路相关基因上影响不同，韦恩图显示各模型间仅部分基因重叠；KEGG富集显示高糖联合高胰岛素和棕榈酸钠可富集到与糖脂代谢相关的通路，而葡萄糖胺在排名靠前的通路中未直接富集到糖脂代谢通路。结合前述表型、信号通路和转录组结果，0.2 mM棕榈酸钠作用24 h操作简单、表型稳定、重复性较好，是本文推荐的HepG2胰岛素抵抗诱导方案。

小编有话说

棕榈酸钠（SP）实验以HepG2细胞为对象，采用0.2 mM作用24 h，细胞活力可接受，葡萄糖消耗和摄取下降，胰岛素刺激后p-AKT/AKT应答减弱，糖异生相关酶表达升高、糖原含量下降，转录组也呈现较稳定的胰岛素抵抗相关改变。细胞处理中应注意接种密度一致、药物现配现用、处理结束充分洗涤并统一检测时间，以减少批间波动。作为高脂细胞添加剂试剂商，我们建议关注棕榈酸钠高脂细胞添加剂的纯度、内毒素和批间稳定性；质量稳定的优级试剂配合规范溶解和浓度梯度预实验，可提升IR-HepG2模型重复性，为代谢病机制研究和药物筛选提供可靠支持。

参考文献

Meng Z, Han Y, Ruan L, Xu C, Zhang M, Liu H. Establishment and evaluation of HepG2 cell insulin resistance model. Diabetes Metab Syndr Obes. 2025;18:2573-2584. doi:10.2147/DMSO.S523821