高脂细胞添加剂（EPA/二十碳五烯酸）暴露对绵羊卵丘-卵母细胞复合体体外成熟及纺锤体形态的影响 ——《Theriogenology》

1. 研究背景

卵母细胞成熟是雌性生育力和早期胚胎发育的关键环节。绵羊体外成熟（IVM）仍是体外胚胎生产（IVEP）的主要限速步骤，常伴随成熟率偏低、成熟阻滞、退化及发育能力下降。以往改善IVM多聚焦促性腺激素、生长因子和抗氧化剂，但卵母细胞成熟还依赖广泛的胞质重塑，包括细胞器重排、细胞骨架重组和代谢重编程。脂质既通过β-氧化供能，又为膜重塑提供结构组分并参与信号转导；反刍动物卵母细胞富含胞内脂滴，因此脂质代谢与卵母细胞质量、发育能力密切相关。近年脂质组学已开始揭示与卵母细胞能力相关的脂质特征：牛卵母细胞中PC、PE、PI较高与发育潜能相关，猪卵母细胞GV到MII过程中PE、PI及醚联PE增加。但绵羊卵母细胞GV向MII转变中的脂质组景观尚不完整，阶段相关脂质变化的功能意义也不清楚。本文即围绕绵羊卵母细胞IVM中的脂质动态、外源磷脂酰胆碱（PC）和二十碳五烯酸（EPA）补充效应展开探索，为脂质补充策略提供依据。

2. 技术路线与实验思路

研究采用“脂滴成像—低输入脂质组学—补充干预—表型验证”的路线。先比较GV、MII及未完成成熟（OMF）卵母细胞的BODIPY 493/503和Oil Red O染色及脂滴分布；再用UHPLC-MS/MS低输入脂质组学，对3对匹配GV-MII批次、每样本120枚 pooled卵母细胞进行620个注释条目分析，以limma线性模型纳入批次和发育阶段，按未校正P<0.05且FC≥1.5或≤1/1.5进行探索性筛选；随后在IVM中补充10 μM PC或100/300 μM EPA，评估核成熟、生发泡破裂（GVBD）、脂滴荧光和纺锤体形态。

图1 技术路线图

3. 绵羊COCs的EPA暴露IVM细胞模型

细胞实验以绵羊卵丘-卵母细胞复合体（COCs）为对象。卵巢采自屠宰场，2 h内37℃盐水转运，清洗后从2–6 mm窦卵泡解剖COCs，按卵丘层数和覆盖度分级：>5层完整致密卵丘为Grade A/B，覆盖<50%为Grade C。完整GV期COCs随机分组，40枚/孔，400 μL IVM液，38.5℃、5% CO2培养24 h。PC用DMSO溶解，终浓度10 μM，DMSO终浓度低于0.05%（v/v），对应载体对照加入等体积DMSO。二十碳五烯酸（EPA）以即用型6 mM液体制剂提供，用IVM培养基稀释至终浓度100或300 μM；载体对照加入与300 μM EPA组等体积的供应商空白载体。PC实验同时观察Grade A/B和Grade C COCs，EPA实验选用Grade A/B COCs。IVM后吹打去卵丘，第一极体排出判为MII，未排出判为OMF；8 h评估GVBD；免疫荧光检测α-tubulin和DAPI，分类正常/异常纺锤体，这些处理为后续高脂/脂肪酸添加剂实验提供细胞选型、剂量和对照逻辑。

图2 高脂细胞添加剂型号

其中，二十碳五烯酸（EPA）高脂细胞添加剂（货号KC020，Kunchuang biotechnology）包含独立包装的6 mmol/L EPA、及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的高脂细胞添加剂相比，具有溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶、浓度准确、能够呈现清晰的剂量依赖性趋势等显著优势。需要说明的是，针对不同细胞种类及实验目的，本产品所用浓度不同，一般与培养基总体积按1:60-1:12稀释，终浓度为100-500μmol/L。对于首次使用本产品，建议采用浓度梯度处理细胞，摸索针对特定细胞、达到特定效果的适宜浓度。处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24-48小时为宜。 

4. 高脂细胞添加剂实验操作要点

细胞选型上，EPA实验选用Grade A/B COCs，即卵丘层数多、覆盖完整致密的优质COCs，以减少卵丘覆盖差异对成熟结果的混杂；PC实验则同时观察Grade A/B和Grade C，其中Grade C用于检验低质量COCs对PC补充的响应。培养操作上，完整GV期COCs按40枚/孔置于400 μL IVM培养基，38.5℃、5% CO2培养24 h；EPA在IVM全程暴露，8 h单独评估GVBD，24 h后去卵丘并统计MII率。去卵丘采用0.25%透明质酸酶38.5℃消化5 min并轻柔吹打，避免机械损伤干扰第一极体判定。纺锤体检测在MII卵母细胞中进行：固定、1% Triton X-100透化、3% BSA封闭、抗α-tubulin（1:200）4℃过夜、Alexa Fluor 488二抗（1:1000）室温避光2 h、DAPI染核7 min，共聚焦60×油镜单光学切片采集；每批至少30枚/组，三批独立重复，三名观察者盲法分类正常双极桶状纺锤体与双极破坏/微管紊乱的异常纺锤体。这些细胞处理细节保证了EPA暴露的剂量、时间、载体对照和表型判读的可重复性。

脂质组学为EPA实验提供了“现象—候选—干预”的线索。其中：低输入脂质组学以GV和MII卵母细胞各120枚池化为样本，经脂质提取和UHPLC-MS/MS分析，覆盖30类脂质、619个分子条目加1个游离胆固醇共620个条目；其中TAG条目最多（109），其次为PC（71）、PE（47）、醚联PE（41）、CL（39）、神经酰胺（36）和醚联PC（35），说明卵母细胞脂质覆盖广，具备筛选脂肪酸和磷脂候选的基础。PCA中PC1和PC2分别解释35.69%和27.24%的方差，GV与MII呈阶段相关分离；按未校正P<0.05且FC≥1.5或≤1/1.5筛选得到81个候选（59个在MII升高、22个降低），但无条目通过多重检验校正阈值，因此仅为探索性候选，需独立验证。PC、PE、PI、PG和FA条目的标准化丰度热图及配对点图显示，FA 20:5在MII中估计丰度较低，MII/GV Fold change为0.594，未校正P=0.0137。这一“MII中EPA/FA 20:5偏低”的观察与后续外源EPA补充实验形成对照：内源阶段模式提示成熟过程可能伴随EPA相关脂质重塑，但外源增加EPA是否有利仍需直接检验。

图3 EPA补充对Grade A/B COCs IVM的影响

如图3所示，图中展示了EPA补充对GradeA/BCOCsIVM的影响。图3A为对照、100μMEPA和300μMEPA组IVM后的代表性图像，上排为MII卵母细胞，下排为第一极体（PB1）排出情况；随EPA浓度升高，PB1排出减少。图3B显示8hGVBD率在三组间无统计学显著差异，提示EPA未明显阻断减数分裂启动。图3C显示EPA处理组MII成熟率低于载体对照，提示EPA可能主要影响GVBD后的成熟推进。图3D为对照与300μMEPA组MII卵母细胞的α-tubulin/DAPI免疫荧光代表图，绿色为微管、蓝色为DNA，300μMEPA组可见纺锤体双极组织破坏或微管紊乱。图3E显示300μMEPA组异常纺锤体形态比例显著升高（P<0.01）。

结合文中FA 20:5在MII中较低，可以理解为：外源EPA在本文测试条件下并未复现“内源较低即需补充”的简单逻辑，反而与MII率下降和纺锤体异常相关。这提示脂肪酸添加剂的效果取决于脂肪酸种类、剂量、递送载体、暴露时长、细胞状态和物种；评价时不能只看GVBD，必须看MII推进和纺锤体等胞质/细胞骨架终点。

与EPA不同，PC补充的效应主要体现在形态学低质量的Grade C COCs。Grade A/B COCs中PC处理组与DMSO载体对照的核成熟率无统计学显著差异；Grade C COCs经10 μM PC处理后核成熟率显著高于载体对照（P<0.01），所得MII卵母细胞BODIPY 493/503荧光亦显著高于对应载体对照（P<0.001）。这提示PC可用性可能与卵丘覆盖较少的COCs成熟改善有关；但PC的膜结构作用、作为卵磷脂:视黄醇酰基转移酶酰基供体的代谢作用，以及脂质储存改变的具体贡献尚不能区分。后续应测试定义明确的PC分子种，并比较完整COCs与裸卵，以明确卵丘细胞参与程度。

5. 总结与展望

综上，二十碳五烯酸（EPA）相关实验以绵羊Grade A/B COCs为细胞对象，在IVM全程24 h暴露100/300 μM EPA，采用供应商空白载体匹配体积对照，以GVBD、MII率、第一极体和α-tubulin/DAPI纺锤体形态为主要终点。结果显示EPA未显著改变8 h GVBD，但降低MII成熟率，300 μM还与异常纺锤体比例升高相关；这为脂肪酸添加剂在卵母细胞成熟中的剂量和终点选择提供了可复用流程。鲲创生物（Kunchuang Biotechnology）提供的高纯度EPA即用型6 mM液体制剂，纯度高、即用型、便于梯度稀释和载体匹配对照，适合用于卵母细胞/颗粒细胞脂肪酸暴露、纺锤体毒性及脂质代谢重塑研究；结合低输入脂质组学和靶向磷脂验证，有望进一步优化IVM脂质补充策略。

参考文献

Zhang Y, Li W, Peng J, Lu J, Chen K, Gao L, Su J. Low-input lipidomics reveals stage-specific lipid remodeling and differential effects of phosphatidylcholine and eicosapentaenoic acid during ovine oocyte maturation. Theriogenology. 2026; Article S0093691X26004875. Elsevier Inc.