Front. Immunol.（IF 7）：高脂细胞添加剂诱导BMDM脂质负荷细胞模型以研究APOE相关巨噬细胞脂质处理

1. 研究背景

肝细胞癌（HCC）仍是全球高发病率、高致死率恶性肿瘤，HCC的发生并非孤立恶性转化事件，而是长期慢性肝损伤、炎症、纤维化、血管重塑和代谢功能障碍共同作用的结果。肝脏本身承担脂蛋白组装、胆固醇转运、脂肪酸氧化和解毒代谢等核心代谢功能，并具有外周免疫耐受特征，因此HCC免疫微环境具有器官特异性。肿瘤及基质可持续改变局部营养可用性、脂质与胆固醇代谢、氧化还原压力和死亡细胞清除需求，进而影响浸润免疫细胞功能状态。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）兼具吞噬、脂质处理、组织修复和免疫调节功能，可通过影响炎症、T细胞浸润、血管生成和细胞外基质重塑参与抗肿瘤免疫塑造。HCC单细胞研究已显示肿瘤浸润髓系细胞并非单一免疫抑制群体，而包含炎症、组织驻留、脂质处理、抗原提呈和促瘤等多种状态。

脂质相关巨噬细胞和TREM2阳性巨噬细胞在代谢性肝病、组织修复及肿瘤微环境重塑中具有阶段和情境依赖功能；HCC中特定代谢特征肿瘤细胞可通过氧化低密度脂蛋白（oxLDL）相关代谢串扰诱导促瘤TREM2阳性TAM状态并促进免疫抑制。然而，哪些脂质处理程序参与形成HCC中肿瘤富集的TAM状态、如何连接肿瘤相关细胞间通讯、是否支持肿瘤生长仍未充分阐明。APOE作为脂蛋白转运和胆固醇再分配关键分子，其基因座亦与HCC易感性相关，因而成为连接髓系脂质处理与微环境重塑的候选入口。

2. 技术路线与实验思路

如图1所示，本文围绕“人单细胞筛选—髓系状态刻画—通讯推断—体内遗传扰动—小鼠单细胞验证—细胞脂质负荷实验”展开。首先，利用10例HCC配对肿瘤与癌旁单细胞转录组，从免疫细胞组成、代谢通路活性和肿瘤上调脂质相关基因三个角度筛选候选因子，优先锁定APOE。随后提取髓系细胞再聚类，鉴定肿瘤富集的APOE阳性巨噬细胞，并用功能模块评分刻画其脂质/胆固醇处理、内溶酶体和氧化还原特征；再用CellChat推断其作为发送者或接收者的候选配体—受体通讯。体内通过宿主Apoe缺失与肿瘤细胞Apoe敲低模型，结合Hepa1-6皮下瘤、Nras-Myc肝肿瘤模型及小鼠单细胞转录组，评估Apoe扰动对肿瘤生长和髓系状态的影响。最后，用WT与Apoe-/-来源BMDM，在油酸（钠）或oxLDL负荷下经BODIPY染色验证脂质蓄积表型。整体形成从人群关联到动物表型再到细胞机制验证的闭环。该路线的核心在于分层递进：人群单细胞数据用于提出APOE候选并定义肿瘤富集巨噬细胞状态，CellChat用于形成细胞间通讯假设，宿主Apoe缺失与肿瘤细胞Apoe敲低用于区分不同细胞来源的贡献，小鼠单细胞用于解析宿主Apoe缺失伴随的髓系状态和功能程序重塑，BMDM脂质负荷实验则用于验证巨噬细胞自主的脂质处理表型。由此将转录组关联、通讯推断、体内因果扰动和体外细胞表型串联起来，既避免仅停留在相关性描述，也为后续细胞特异性Apoe扰动和机制研究提供明确切入点。

图1 技术路线图

3. 细胞模型

使用小鼠肝癌Hepa1-6细胞，以DMEM加10%胎牛血清、37℃、5% CO2培养，使用前确认无支原体污染；以慢病毒shRNA构建稳定Apoe敲低细胞，靶向载体为pLV3-U6-Apoe(mouse)-shRNA-CopGFP-Puro，对照为非靶向scramble载体，两者均带CopGFP和嘌呤霉素抗性，转导后以10 μg/mL嘌呤霉素筛选3—5天获得稳定敲低及匹配对照细胞；用qPCR和Western blot验证，qPCR以β-actin为内参、2^-ΔΔCT法计算相对Apoe表达，Western blot以抗ApoE兔单抗E7X2A（CST#49285，1:1000）检测，以β-actin兔单抗（1:1000）为加载对照，使用HRP标记抗兔IgG（CST#7074S，1:1000）二抗和Super ECL检测。另从WT与Apoe-/-小鼠骨髓分离细胞，以M-CSF 25 ng/mL诱导7天分化为骨髓来源巨噬细胞（BMDM），用于未处理、油酸（钠）或oxLDL负荷及BODIPY 493/503染色流式检测。上述细胞模型与高脂负荷处理为后续体内表型和脂质处理程序分析提供了可操作的实验基础。

图2 高脂细胞添加剂型号

其中，该高脂细胞添加剂（货号KC006）包含独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠、12 mmol/L油酸钠及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的高脂细胞添加剂相比，具有溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶、浓度准确、能够呈现清晰的剂量依赖性趋势等显著优势。需要说明的是，棕榈酸（钠）可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸（钠）可以用来诱导细胞代谢异常、细胞脂质堆积。棕榈酸（钠）和油酸（钠）可以单独使用，也可以联合使用，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

4. 高脂细胞添加剂实验操作要点

图3展示了细胞层面直接量化“脂质负荷后中性脂质蓄积”的实验，把APOE相关巨噬细胞脂质处理从转录组关联落到可测量表型。如图3A所示BMDM分离与BODIPY 493/503染色流程示意：分别从WT与Apoe-/-小鼠分离骨髓细胞，以M-CSF 25 ng/mL诱导分化7天得到BMDM，随后分为未处理、油酸（钠）处理和人oxLDL处理三组，再以BODIPY 493/503染色并流式检测。图3B为未处理条件下的代表性流式结果和脂滴定量，WT与Apoe-/-组BODIPY信号无显著差异（ns），说明Apoe缺失本身并不必然改变基础中性脂质水平。图3C为油酸（钠） 200 μM处理24 h后的流式结果图和脂滴定量，Apoe-/-组BODIPY信号显著高于WT组（P<0.001）。图3D为oxLDL 50 μg/mL处理24 h后的流式结果图和脂滴定量，Apoe-/-组同样显著升高（P<0.01）。这些数据显示：基础状态下差异不明显，一旦给予外源脂质负荷，Apoe缺失即表现为更强的中性脂质蓄积。

 图3 Apoe缺失增加脂质负荷BMDM的中性脂质蓄积

高脂细胞添加剂实验直接测量了“脂质处理”这一核心变量的下游结果——中性脂质蓄积。前文的人单细胞和小鼠单细胞分析提示APOE阳性巨噬细胞富集脂质摄取、胆固醇处理、内溶酶体处理和脂质货物路由程序，但这些都属于表达层面的关联；图3则用BODIPY 493/503直接标记中性脂滴，在蛋白/细胞表型层面证明Apoe缺失确实改变了巨噬细胞对外源脂质的处理能力。更重要的是，该实验区分了“基础状态”和“负荷状态”：图3B的阴性结果不支持Apoe缺失导致基础脂质普遍升高的简单解释，而图3C、3D的阳性结果把差异锁定在“应答脂质负荷”这一特定环节，与论文提出的APOE参与脂质货物路由和内溶酶体处理的模型高度吻合。此外，该实验使用BMDM，比细胞系更接近体内髓系细胞状态，且WT与Apoe-/-来源细胞在相同分化条件下平行处理，因果对比清晰。因此，图3是全文细胞层面最直接、最可量化的表型验证，为“APOE相关巨噬细胞脂质处理程序”提供了功能落点。

实验要点小结

本文的高脂细胞添加剂实验以BMDM为核心，采用M-CSF 25 ng/mL诱导7天、油酸（OA） 200 μM或oxLDL 50 μg/mL处理24 h、BODIPY 493/503 2 μM 37℃染色15 min后流式定量脂滴，结果显示Apoe缺失在脂质负荷而非基础状态下增强中性脂质积累；细胞处理环节则包括Hepa1-6的DMEM/10%FBS培养、慢病毒shRNA转导、10 μg/mL嘌呤霉素筛选3—5天及qPCR/WB验证。这些参数为研究巨噬细胞脂质处理与HCC微环境重塑提供了稳定、可复现的实验框架。针对此类肿瘤免疫代谢研究，稳定批次的高脂细胞添加剂和检测试剂是获得可重复表型的关键；我们可提供油酸、油酸钠等高脂细胞添加剂，助力巨噬细胞脂质负荷、脂滴定量和代谢免疫机制研究，欢迎根据实验体系选择合适浓度与处理时长。

参考文献

Wu et al. APOE-associated macrophage lipid handling and host microenvironmental remodeling in hepatocellular carcinoma. Frontiers in Immunology, 2026, 17:1902143.